مقاله در مورد روش شناسائی یرسینیا انتروکلی تیکا در مواد غذائی

بخشی از مقاله

روش شناسائي يرسينيا انتروكلي تيكا در مواد غذائي

-0 مقدمه

جنس يرسينيا با پذيرفتن نام‌هاي متعددي چون فلاوباكتريوم پسودومولئي، باكتريوم انتروكلي تيكا، پاستور لاپسودوتوبركلوزيس، پاستور X و ژرم X نهايتا از سال 1974 از خانواده پاستور لاسه جدا و به همراه سه گونه اصلي يرسينياپستيس، يرسينيا پسودوتوبركلوزيس و يرسينيا انتروكلي تيكا بطور قطعي در خانواده آنتروباكتريا سه جاي گرفت.

اين باكتريها از جمله بيماري زاهاي مشترك انسان و دام هستند و مهم ترين گونه‌اي كه نقش آن در بيماري زايي انسان از سال 1965 به اثبات رسيده است يرسينيا انتروكلي تيكا مي‌باشد، شير خام، گوشت، سبزيجات و آب مي‌تواند بعنوان منبع آلودگي اين باكتري مطرح باشد.

يرسينيا انتروكلي تيكا مي‌تواند عامل بيماري معدي روده‌اي، آدنيت مزانتريك، اريتم گره‌دار عفونت خوني و پلي آرتريت باشد. اين ارگانيسم، كوكو باسيلي است گرم منفي، بدون كپسول، بي‌هوازي اختياري بطول 1-3 ميكرومتر و عرض 0/5 - 0/8 ميكرومتر كه حركت آن فقط در دماي پائين تر از 30 درجه سلسيوس به كمك فلاژل‌هاي پيراموني صورت مي‌گيرد. دماي مناسب رشد آن 28-29 درجه سلسيوس PH مناسب آن 7/2 - 7/4 است و مانند اكثر آنتروباكترياسه‌ها گلوكز را بدون گاز تخمير مي‌كند و اكسيداز منفي است.

سروتيپ‌هاي جديدي چون 0:13a; 13b, 0:4,32, 0:5,27, 0:21 بيماري‌زا تشخيص داده شده‌اند.

بيشترين سروتيپ‌هاي بيماري‌زا 0:3 0:8, 0:9 مي‌باشد.

از نظر سرولوژي آگلوتيناسيون‌هاي متقاطع با ارگانيسم‌هايي مانند سالمونلا، بروسلا، شيگلا، اشري شياكلي و ويبربو گزارش شده است.

1 ـ هدف و دامنه كاربرد
هدف از تدوين اين استاندارد ارائه روش جداسازي و شناسايي يرسينيا انتروكلي تيكاي بيماري زا براي انسان است . اين روش در مورد فرآورده‏هاي غذايي انسان و دام كاربرد دارد . 2 ـ واژه‏ها و تعاريف در اين استاندارد واژه‏ها با تعاريف زير بكار مي‏روند :
هدف از تدوين اين استاندارد ارائه روش جداسازي و شناسايي يرسينيا انتروكلي تيكاي بيماري زا براي انسان است . اين روش در مورد فرآورده‏هاي غذايي انسان و دام كاربرد دارد .

2 ـ واژه‏ها و تعاريف
در اين استاندارد واژه‏ها با تعاريف زير بكار مي‏روند : 2 ـ 1 ـ يرسينيا آنتروكلي تيكاي بيماري زا باكتريهاي سرما گرايي هستند كه اگر طبق روش مشروح در اين استاندارد آزمايش شوند روي محيط هاي جامد انتخابي پرگنه‏هاي ويژه‏اي ايجاد مي‏نمايند كه از نظر خواص بيوشيميايي با معيارهايي بيماري زائي اين استاندارد مطابقت مي‏كند .
در اين استاندارد واژه‏ها با تعاريف زير بكار مي‏روند :

2 ـ 1 ـ يرسينيا آنتروكلي تيكاي بيماري زا

باكتريهاي سرما گرايي هستند كه اگر طبق روش مشروح در اين استاندارد آزمايش شوند روي محيط هاي جامد انتخابي پرگنه‏هاي ويژه‏اي ايجاد مي‏نمايند كه از نظر خواص بيوشيميايي با معيارهايي بيماري زائي اين استاندارد مطابقت مي‏كند .

2 ـ 2 ـ شناسايي يرسينيا آنتروكلي تيكا

شامل حضور يا عدم حضور اين باكتري در مقدار معيني از فرآورده غذايي است كه بر طبق روش مشروح در اين استاندارد تعيين مي‏شود .

3 ـ اساس آزمايش

شناسايي يرسينيا آنتروكلي تيكاي احتمالا بيماري زا در طي سه مرحله پي در پي زير صورت مي‏گيرد . 3 ـ 1 ـ غني سازي در محيط مايع انتخابي 3 ـ 1 ـ 1 ـ كشت نمونه مورد آزمون در دو محيط غني كننده زير :
شناسايي يرسينيا آنتروكلي تيكاي احتمالا بيماري زا در طي سه مرحله پي در پي زير صورت مي‏گيرد .

3 ـ 1 ـ غني سازي در محيط مايع انتخابي

3 ـ 1 ـ 1 ـ كشت نمونه مورد آزمون در دو محيط غني كننده زير :

الف آبگوشت نمك هاي صفراوي و سوربيتول و پپتن

Peptone Sorbitol and Bile salts Broth (PSB )

ب : آبگوشت ايرگازان ـ تيكارسيلين وكلرات پتاسيم

Jrgasan ticarcillin and Potassium chlorate broth (ITC)

3 ـ 1 ـ 2 ـ گرمخانه گذاري

كشت (PSB) در دماي 25 ـ 22 درجه سلسيوس بمدت 3 تا 5 روز

كشت (ITC) در دماي 25 ـ 22 درجه سلسيوس بمدت 2 روز (48 ساعت )

3 ـ 2 ـ كشت در محيطهاي جامد

كشت سطحي از محيطهاي PSB.ITC بترتيب در محيطهاي جامد زير :

3 ـ 2 ـ 1 ـ محيط سفسولودين ـ ايرگازان و نووبيوسين آگار

Cefsulodin Irgasan and novobiocin agar (CIN)

3 ـ 2 ـ 2 ـ محيط سالمونلا ـ شيگلا آگار حاي ذركسي كلات سديم و كلرور كلسيم

Salmonella / Shigella agar with Sodium desoxychlate and Calcium chloride (SSDC)

3 ـ 2 ـ 3 ـ گرمخانه گذاري

محيطهاي CIn و SSDC در دماي 30 درجه سلسيوس گرمخانه گذاري كنيد . پس از 24 ساعت و در صورت لزوم پس از 48 ساعت متناسب با محيط , كشت ها را به منظور حضور پرگنه هاي ويژه يرسينيا آنتروكلي تيكا بررسي كنيد .

3 ـ 3 ـ تاييد

در اين مرحله روي پرگنه‏هاي مشكوك به يرسينيا آزمايش‏هاي بيوشيميايي , آزمايش هاي خاص منطبق با معيارهاي بيماري زايي و در صورت امكان آزمايش هاي سرولوژيكي براي تاييد انجام مي‏شود .

به راهنماي روش كار مراجعه شود .

4 ـ محيطهاي كشت ومعرف هاي لازم

4 ـ 1 ـ كليات بدليل تعداد زياد محيطهاي كشت و معرف‏ها و براي وضوح شرح آزمايش , تركيبات محيطها , جزييات مربوط به تقسيم و نگهداري آنها به صورت پيوست در استاندارد آمده است . 4 ـ 2 ـ محيطهاي غني كننده
4 ـ 1 ـ كليات

بدليل تعداد زياد محيطهاي كشت و معرف‏ها و براي وضوح شرح آزمايش , تركيبات محيطها , جزييات مربوط به تقسيم و نگهداري آنها به صورت پيوست در استاندارد آمده است .

4 ـ 2 ـ محيطهاي غني كننده

4 ـ 2 ـ 1 ـ محيط مايع حاوي پيتن , سوربيتول و نمكهاي صفرا (PSB)

4 ـ 2 ـ 2 محيط مايع حاوي ايرگازان ـ تيكارسيلين وكلرات پتاسيم (ITC)

4 ـ 3 ـ محيطهاي كشت

4 ـ 3 ـ 1 ـ سفسولودين ـ ايرگازان و نووبيوسين حاوي آگار (CIN)

4 ـ 3 ـ 2 ـ سالمونلا ـ شيگلا آگار حاوي ذركسي كلات سديم و كلرور سديم (SSDC)

4 ـ 3 ـ 3 ـ نوترنيت آگار

4 ـ 4 ـ محيط هاي شناسايي ومعرفها

4 ـ 4 ـ 1 ـ محيط كشت اوره تريپتوفان

4 ـ 4 ـ 2 ـ معرف شناسايي تريپتوفان دي آميناز

4 ـ 4 ـ 3 ـ كليگر آگار

4 ـ 4 ـ 4 ـ معرف تشخيص اكسيداز

4 ـ 4 ـ 5 ـ محيط هاي كشت دكربوكسيلاز

4 ـ 4 ـ 5 ـ 1 ـ محيط كشت لايزين دكربوكسيلاز

4 ـ 4 ـ 5 ـ 2 ـ محيط كشت اورني تين دكربوكسيلاز

4 ـ 4 ـ 6 ـ محيط براي تخمير قندها ( ساكارز ( رامنوز يا ساليسين )

4 ـ 4 ـ 7 ـ محيط سيمون سيترات

4 ـ 4 ـ 8 ـمحيط صفرا و اسكولين آگاردار

4 ـ 4 ـ 9 كازئين سويا اگاردار

4 ـ 4 ـ 10 ـ كارتين سويا آگار دار براي شناسايي آميداز

4 ـ 4 ـ 11 ـ محلول سولفات آمونيوم و آهن دو ظرفيتي براي شناسايي پيرازين آميداز

مازئين سويا آگاردار حاوي منيزيم وآگزالات

4 ـ 5 ـ سرم فيزيولوژي

4 ـ 6 ـ پتاسيم هيدروكسايد در سرم فيزيولوژي

4 ـ 7 ـ محيط SIM آگار

5 ـ وسايل ضروري
يادآوري : بجاي ظرف شيشه‏اي چند بار مصرف از وسايل يكبار مصرف بشرط دارابودن ويژگيهاي مناسب مي‏توان استفاده كرد. . 5 ـ 1 ـ وسيله سترون كردن خشك ( آون ) يا سترون كردن مرطوب ( اتوكلاو ) 5 ـ 2 ـ گرمخانه قابل تنظيم در 22±1درجه سلسيوس و 25±1درجه سلسيوس.
يادآوري : بجاي ظرف شيشه‏اي چند بار مصرف از وسايل يكبار مصرف بشرط دارابودن ويژگيهاي مناسب مي‏توان استفاده كرد. .

5 ـ 1 ـ وسيله سترون كردن خشك ( آون ) يا سترون كردن مرطوب ( اتوكلاو )

5 ـ 2 ـ گرمخانه قابل تنظيم در 22±1درجه سلسيوس و 25±1درجه سلسيوس.

5 ـ 3 ـ قفسه خشك كردن يا آون داراي تهويه هوا با جابجايي و قابل تنظيم در 37±1 درجه و 55±1 درجه سلسيوس

5 ـ 4 ـ حمام آب قابل تنظيم در دماي 45±0/5درجه سلسيوس و 50±0/5درجه سلسيوس

5 ـ 5 ـ لوله‏هاي آزمون با ابعاد 180*18 و 180*9 و 50*12 ميلي متر

5 ـ 6 ـ ظروف شيشه اي و بطري هاي با گنجايش مناسب

5 ـ 7 ـ ظروف پتري شيشه‏اي يا پلاستيكي بقطر 100 ـ 90 ميلي متر

5 ـ 8 ـ پي پت‏هاي 1 و 10 ميلي ليتري با درجه بندي 0/1 ميلي ليتر

5 ـ 9 ـ مكنده‏هاي لاستيگي ( پوآر ) مخصوص پي پت

5 ـ 10 ـ حلقه كشت بقطر تقريبي 3 ميلي متر و سوزن كشت سر صاف از جنس پلاتين / ايريدوم يا نيكل / كروم و يا پي پت پاستور شيشه‏اي بجاي سوزن كشت .

يادآوري : حلقه و سوزن كشت يكبار مصرف مي‏تواند استفاده شود حلقه كشت از جنس نيكل / كرم براي انجام آزمون اكسيداز مناسب نيست .

5 ـ 11 ـ PH متر بادقت ±0/1 واحد PH در 25 درجه سلسيوس

5 ـ 12 ـ منبع نور مناسب براي تابش مورب

5 ـ 13 ـ ذره بين يا ميكروسكوپ

5 ـ 14 ـ مخلوط كن ( استوماكر )

6 ـ نمونه برداري

نمونه برداري از فرآورده بايد با رعايت اصول مربوط به نمونه برداري فرآورده غذايي براي آزمايش‏هاي ميكربي صورت گيرد . نمونه‏اي كه به آزمايشگاه مي‏رسد بايد معرف واقعي كالا بوده و در حين نمونه برداري و حمل و نقل دچار آسيب ديدگي و تغيير نشده باشد . 7 ـ آماده كردن نمونه نمونه مورد آزمون با توجه به استاندارد ملي شماره 356 ايران (( آماده كردن نمونه غذايي و تهيه رقم اعشاري نمونه براي آزمايش هاي ميكربي )) آماده شود .
نمونه برداري از فرآورده بايد با رعايت اصول مربوط به نمونه برداري فرآورده غذايي براي آزمايش‏هاي ميكربي صورت گيرد . نمونه‏اي كه به آزمايشگاه مي‏رسد بايد معرف واقعي كالا بوده و در حين نمونه برداري و حمل و نقل دچار آسيب ديدگي و تغيير نشده باشد .

7 ـ آماده كردن نمونه
نمونه مورد آزمون با توجه به استاندارد ملي شماره 356 ايران (( آماده كردن نمونه غذايي و تهيه رقم اعشاري نمونه براي آزمايش هاي ميكربي )) آماده شود . 8 ـ روش آزمايش 8 ـ 1 ـ سوسپانسيون‏هاي اوليه
نمونه مورد آزمون با توجه به استاندارد ملي شماره 356 ايران (( آماده كردن نمونه غذايي و تهيه رقم اعشاري نمونه براي آزمايش هاي ميكربي )) آماده شود .

8 ـ روش آزمايش
8 ـ 1 ـ سوسپانسيون‏هاي اوليه 8 ـ 1 ـ 1 ـ مقدار معيني ( وزن ي حجم نمونه ) از نمونه مورد آزمايش را به حجم مشخصي از محيط PSB منتقل كنيد بطوري كه رقت يكدهم وزن به حجم يا حجم به حجم بدست آيد و بعد با استوماكر آن را مخلوط كنيد تا يكنواخت شود . 8 ـ 1 ـ 2 سوسپانسيون ديگري از نمونه , با محيط ITC با رقت وزن به حجم يا حجم به حجم تهيه كنيد .
8 ـ 1 ـ سوسپانسيون‏هاي اوليه

8 ـ 1 ـ 1 ـ مقدار معيني ( وزن ي حجم نمونه ) از نمونه مورد آزمايش را به حجم مشخصي از محيط PSB منتقل كنيد بطوري كه رقت يكدهم وزن به حجم يا حجم به حجم بدست آيد و بعد با استوماكر آن را مخلوط كنيد تا يكنواخت شود .

8 ـ 1 ـ 2 سوسپانسيون ديگري از نمونه , با محيط ITC با رقت وزن به حجم يا حجم به حجم تهيه كنيد .

8 ـ 2 ـ غني سازي 1

8 ـ 2 ـ 1 ـ محيط PSB كشت شده را در 25 ـ 22 درجه سلسيوس بمدت 5 روز بدون هم زدن و 2 تا 3 روز با هم زدن قرار دهيد .

8 ـ 2 ـ 2 ـ محيط ITC كشت شده را در 25 درجه سلسيوس براي 2 ورز (

48 ساعت ) گرمخانه گذاري كنيد .

8 ـ 3 ـ كشت

8 ـ 3 ـ 1 ـ با حلقه كشت از محيط (PSB) برداريد و روي محيط جامد (CIN) طوري كشت دهيد كه پرگنه هاي مجزا حاصل شود .

8 ـ 3 ـ 2 ـ با پي پت سترون , 0/5 ميلي ليتر از كشت PSB را به 4/5 ميلي ليتر

محلول پتاسيم هيدروكسايد ( محيط شماره 20 پيوست ) بيفزاييد و خوب مخلوط كنيد و بعد از 20 ثانيه با حلقه كشت از ان برداريد و در سطح محيط (CIN) طوري كشت دهيد كه پرگنه‏هاي مجزا حاصل شود .

8 ـ 3 ـ 3 ـ با حلقه كشت از ITC كشت شده برداريد و در سطح جامد SSDC براي حصول پرگنه‏هاي مجزا كشت دهيد .

8 ـ 3 ـ 4 ـ ظروف پتري بندهاي 8 ـ 3 ـ 1 و 8 ـ 3 ـ 2 ـ و 8 ـ 3 ـ 3 را بطور وارونه در گرمخانه در دماي 30 درجه سلسيوس براي 24 ساعت قرار دهيد .

8 ـ 3 ـ 5 ـ ظروف پتري را از گرمخانه خارج و آنها را به منظور شناسايي پرگنه هاي ويژه يرسينيا آنتروكلي تيكا در نور مايل (45 درجه ) با ذره بين بررسي كنيد .

الف - پرگنه هاي يرسينيا آنتروكلي تيكا در محيط CIN

كوچك ( برابر يا كوچكتر از يك ميلي متر ) صاف يا مركز قرمز و حاشيه شفاف و در زير نور مايل با ظاهري گرانول دار ريز و بدون قوس و قزح است .

ب - پرگنه‏هاي يرسينيا آنتروكلي تيكا در محيط SSDC

كوچك ( برابر يا كوچكتر از يك ميلي متر ) خاكستري رنك يا حاشيه نامشخص و در زير نور مايل با ظاهري دانه دار و ريز و بدون قوس و قزح است

8 ـ 3 ـ 6 ـ اگر پرگنه هاي يرسينياريز و يا كمرنگ باشند و يا ديده نشوند ظروف پتري را براي 24 ساعت ديگر گرمخانه گذاري كنيد .

8 ـ 3 ـ 7 ـ انتخاب پرگنه‏ها

از هر ظرف پتري هر يك از محيطهاي انتخابي بند 8 ـ 3 ـ 1 و 8 ـ 3 ـ 2 و 8 ـ 3 ـ 3, 5 پرگنه مشكوك برداريد . اگر در يك ظرف 5 پرگنه مشكوك يا كمتر وجود داشت تمام آنها را براي تاييد برداريد .

8 ـ 3 ـ 8 ـ جدا سازي پرگنه‏ها

پرگنه‏هاي انتخاب شده را روي محيط نوتر نيت آگار ( محيط شماره 5 پيوست ) كشت خطي دهيد و سپس ظروف پتري را براي 24 ساعت و در 30 درجه سلسيوس گرمخانه گذاري كنيد . پس از اين مدت ظروف از گرمخانه خارج و آنها را در دماي ( 5 ـ 0) درجه سلسيوس ( دماي يخچال ) براي آزمايش‏هاي تاييدي و بيماري زايي نگهداري كنيد .

9 ـ آزمايش هاي بيو شيميايي

از كشت هاي خالص براي آزمايش هاي زير استفاده مي‏شود . 9 ـ 1 ـ آزمايش هاي تشخيص بيو شيميايي 9 ـ 1 ـ 1 ـ آزمايش اوره از
از كشت هاي خالص براي آزمايش هاي زير استفاده مي‏شود .

9 ـ 1 ـ آزمايش هاي تشخيص بيو شيميايي

9 ـ 1 ـ 1 ـ آزمايش اوره از

با ميله شيشه‏اي يا سوزن كشت از پرگنه‏هاي مجزا شده در محيط نوترنيت آگار برداريدو بطور دقيق زير محيط مايع اوره ترپيتوفان ( محيط شماره 6 پيوست ) كشت دهيد و براي 24 ساعت در دماي 30 درجه سلسيوس گرمخانه گذاري كنيد .

نتيجه ـ رنگ صورتي بنفش نشان دهنده واكنش مثبت اوره آز است .

رنگ زرد نارنجي نشان دهنده واكنش اوره از است .

9 ـ 1 ـ 2 ـ آزمايش تريپتوفان دي آميناز

سه قطره ازمعرف شناسايي تريپتوفان دي آميناز ( شماره 7 پيوست ) را به كشت حاصل از بند 9 ـ 1 ـ 1 بيفزاييد .

نتيجه : رنگ قهوه‏اي نشان دهنده واكنش مثبت است .

9 ـ 1 ـ 3 ـ كليگلر آگار

از پرگنه‏هاي خالص شده روي نوترينت آگار برداشته و در سطح محيط مورب كليگلر آگار ( شماره 8 پيوست ) بطور خطي كشت دهيد و بعد سوزن را به عمق محيط فرو بريد . سپس آن را در دماي 30 درجه سلسيوس براي 24 ساعت تا 48 ساعت گرمخانه گذاري كنيد و . سپس تغييرات حاصله در محيط را بشرح زير مورد بررسي قرار دهيد و نتيجه‏گيري كنيد .

9 ـ 1 ـ 4 آزمايش اكسيداز

با ميله شيشه‏اي قسمتي از پرگنه مجزا و خالص يرسينيا را برداريد و روي يك كاغذ صافي مرطوب شده با معرف اكسيداز ( شماره 9 پيوست ) يا روي ديسك قابل دسترس تجارتي تماس دهيد ( از سوزن كشت يا حلقه كشت نيكل / كروم براي اين منظور استفاده نشود).

نتيجه : چنانچه رنگ كاغذ صافي در مدت 10 ثانيه ارغواني روشن , بنفش و يا آبي تيره نشود آزمايش اكسيداز منفي است .

توجه ـ علاوه بر آزمايش‏هاي بيوشيميايي فوق از آزمون حركت نيز جهت تشخيص يرسينيا مي‏توان استفاده كرد .

9 ـ 1 ـ 5 ـ آزمايش حركت

از پرگنه هاي مجزا و خالص يريسنيا برداريد و بطور عمودي در دو لوله محتوي محيط SIM آگار ( شماره 21 پيوست ) فرو بريد و يكي از دو لوله را در 25 درجه و ديگري را در 37 درجه سلسيوس براي 24 ساعت گرمخانه گذاري كنيد و پس از اين مدت آنها را بررسي كني

د .

نتيجه : در صورتي كه باكتري در محيط كشت به طرفين انتشار يافته باشد و كدورت در آن منطقه حاصل شده باشد آزمايش حركت مثبت است .

9 ـ 1 ـ 6 ـ انتخاب پرگنه‏ها

پرگنه هايي كه خصوصيات مندرج در جدول شماره يك را دارا هستند براي آزمايش‏هاي تاييدي انتخاب ‏شوند .

(1) – سويه هاي اوره آز منفي از يرسينيا انتروكلي تيكا گزارش شده اند كه بيماري زا نيستند .

(2) – در موقع تشكيل گاز از گلوكز ممكن است كمي حباب هوا ايجاد شود اگر چه يرسينيا معمولا قندها را بدون ايجاد گاز تخمير ميكند ولي بعضي از سويه هاي يرسينيا ( بيووار 3 ) ممكن است يك يا دو حباب ايجاد كند ( ايجاد گاز ضعيف )

(3) – برخي از سويه هاي يرسينيا انتروكلي تيكا لاكتوز + از فراوره هاي لبني جدا شده اند كه معمولا بيماري زا نيستند .

9 ـ 2 ـ آزمايش‏هاي تاييدي بيوشيميايي

9 ـ 2 ـ 1 ـ آزمايش لايزين دكربوكسيلاز

با سوزن با حلقه كشت يا ميله شيشه‏اي از پرگنه هايي مجزا و خالص شده روي نوترنيت آگار برداريد و در محيط لايزين دكربوكسيلاز ( شماره 10 پيوست ) كشت دهيد و براي 24 ساعت در 30 درجه سلسيوس گرمخانه گذاري كنيد .

نتيجه : پيدايش رنگ بنفش در محيط پس از گرمخانه گذاري نشان دهنده واكنش مثبت است و پيدايش رنگ زرد در محيط پس از گرمخانه گذاري نشان دهنده واكنش منفي است .

9 ـ 2 ـ 2 ـ آزمايش اورني تين دكربوكسيلاز

از پرگنه‏هاي خالص برداريد و در محيط اورني تين ( شماره 11 پيوست ) كشت دهيد و 24 ساعت در 30 درجه سلسيوس گرمخانه گذاري كنيد .

نتيجه : پيدايش رنگ بنفش پس از گرمخانه گذاري نشان دهنده واكنش مثبت است و پيدايش رنگ زرد در محيط پس از گرمخانه گذاري نشان دهنده واكنش منفي است .

9 ـ 2 ـ 3 ـ تخمير ساكارز و رامنوز

از پرگنه هيا خالص برداريد و در محيطهاي قندي مايع ( شماره 12 پيوست ) كشت دهيد و براي 24 ساعت در 30 درجه سلسيوس گرمخانه گذاري كنيد .

نتيجه : پيدايش رنگ زرد پس از گرمخانه گذاري نشان دهنده واكنش مثبت است و پيدايش رنگ قرمز پس ازگرمخانه گذاري نشان دهنده واكنش منفي است .

9 ـ 2 ـ 4 ـ هيدروليز سيترات

از پرگنه‏هاي خالص يرسينيا برداريد و در سطح مورب محيط سيمون سيترات ( شماره 13 پيوست ) كشت دهيد و آن را براي 24 ساعت در 30 درجه سلسيوس گرمخانه گذاري كنيد .

نتيجه : پيدايش رنگ آبي در محيط پس از گرمخانه گذاري نشان دهنده و

اكنش مثبت است و اگر در محيط تغيير رنگ ايجاد نشود هيدروليز سيترات منفي است .

9 ـ 3 ـ آزمايش‏هاي تاييدي بيماري زائي