دانلود مقاله روشهای بیوشیمی مطالعة سلول

بخشی از مقاله

روشهاي بيوشيمي مطالعة سلول

سيتوشيمي
با كمك روشهاي سيتوشيمي مي‌توان ساختمانهاي شيميايي اجزاء سلول را در وضعيت طبيعي ( In Situ ) آن شناخت دو راه را براي اين منظور وجود دارد :
1) استفاده از مواد شيميايي كه در اثر تماس با مواد ديگر درون سلول واكنشي ظاهر سازند كه به كمك ميكروسكوپ الكتروني قابل رؤيت است .
براي مطالعة با ميكروسكوپ نوري بايستي اين مواد شيميايي رنگي باشند و براي مشاهده در ميكروسكوپ الكتروني بايد اين مواد مانع حركت الكترونها، يا باعث پراكندگي آنها گردند. (1)

2 ) امكان دوم استفاده از آنزيم‌هايي است كه بطور اختصاصي موادي را تجزيه نمايند اين مواد بعداً در سلول قابل رؤيت نيستند تعيين اينكه محصول يك واكنش جزئي از ساختمان سلول است يا خير زماني ممكن است كه نتيجه واكنش سبب انباشتگي و تراكم ماده مورد جستجو گردد علاوه بر اين واكنش بايد طوري اختصاصي باشد كه قضاوت قابل اعتمادي را ممكن سازد از طرف ديگر اجزاء سلولي به قدر كفايت طبيعي باقي بمانند تا مقايسه و قضاوت را ممكن سازند (مثلاً تراكم موادي در ميتوكندري زماني قابل اثبات است كه ساختمان ميتوكندري به شكل طبيعي آن موجود باشد با دو مثال مطالب فوق روشن مي‌گردد :

در نقاط مختلف سلول فسفاتاز يعني آنزيمي كه هيدر

وليز فسفات را تسريع مي‌نمايد وجود دارد اگر يك سلول ثابت شده با آلدئيد را (آلدئيد فعاليت آنزيمي را از بين نمي‌برد) با مخلوطي از فسفات محلول و نيترات سرب مجاور كنيم (قطره‌اي روي بافت قرار مي‌گيرد) در نقاطي كه آنزيم موجود است فسفات هيدروليز شده و توليد اسيد فسفريك مي‌نمايد كه خود در اثر تركيب با نيترات سرب فسفات سرب به وجود مي‌آورد .
اين تركيب غير قابل حل در آب بوده و توليد رسوبي مي‌نمايد كه به شدت الكترونها را متفرق مي‌كند به اين ترتيب تمام نقاطي كه داراي فسفاتاز هستند در سلول مشخص مي‌گردند .

ديواره غالب سلولهاي گياهي داراي سلولز مي‌باشد كه با املاح فلزات سنگين كنتر است ندارد اگر آنزيم سلولاز را روي سلول ثابت شده با آلدئيد اثر دهيم سلولز به موادي كه ملكولهاي ريز قابل حل در آب تبديل مي‌گردند اين عمل منجر به از بين رفتن كنتر است تقاطعي كه قبلاً سلولز وجود داشت مي‌گردد با اين روش مي‌توان پي به مقدار كمي سلولز در ديواره سلولزي و احتمالاً چگونگي سنتز آن پي برد . (2)

اتوراديوگرافي ( AUTORADIOGRDHY ) :
ايزوتوپهاي راديواكتيو ايزوتوپهايي هستند كه هسته آنها در اثر تشعشع پيوسته تحليل مي‌رود اين گونه ايزوتوپها در سيتولوژي براي رديابي مواد معيني در سلول به كار گرفته مي‌شود با كمك منوساكاريدهاي علامت‌گذاري شده با14 Cمي‌توان بوسيله روشهاي اتوراديوگرافي يا به طور مستقيم توسط اندازه‌گيري فعاليت تشعشعي اجزاء مختلف سلول سنتز پلي‌ساكاريدها را مشخص كرد روش اخير با كمك دستگاه مخصوصي به نام سين‌سيلاسيون شمار (نور ساطع كردن و برق زدن = Scintilation ) انجام مي‌گيرد .

در روش مستقيم اتوراديوگرافي مي‌توان از ميكروسكوپ نوري يا الكتروني استفاده كرد در هر دو مورد بافت بعد از دريافت ماده راديو اكتيو ( خوراندن ـ تزريق ) ثابت آغشته و برش داده مي‌شود مقاطع بعداً با لايه‌اي حساس يا فيلم پوشانده مي‌شوند تشعشعات ماده راديو اكتيو مثل اشعه نور صفحه فيلم يا ماده حساس ديگر را متأثر و فيلم پس از ظهور در محل سياه شده مورد مطالعه قرار مي‌گيرند شرط موفقيت دراتوراديوگرافي انتخاب ماده حساس براي پوشاندن مقاطع انتخاب زمان دقيق براي تأثير اشعه و بالاخره ظاهر كردن مناسب ماده حساس يا فيلم مي‌باشد معذالك نمي‌توان از اين روش در هر موردي از سيتولوژي استفاده نمود اتوراديوگرافي بيش از هر روش ديگر به دقت و تجربه نيازمند است . (2)

جداسازي اجزاء سلول :
براي انجام آزمايشات شيمي با اندازه‌گيري و مطالعه عمل اجزاء مختلفه يك سلول : لازم است كه اين اجزاء از بقيه قسمتها جدا گردند براي اين منظور سلولها هموژن مي‌شوند بعد محتويات سلولها با كمك اولترا سانتريفوژ به صورت بخشهاي مستقلي كه هر يك محتوي ساختمان خاصي از سلول هستند از هم جدا مي‌گردند .
عمل هموژن كردن در سلولهائي كه با ديواره سختي پوشيده نمي‌شوند از طريق شوك اسمزي با تأثير امواج صوتي بالاي Hkz 20 صورت مي‌گيرد .

سلولهاي باديواره سخت بايستي در هموژنيزاتور با چاقو يا گلوله‌هاي شيشه‌اي ذرات كوارتز و نظاير آن ساييده شوند در هر حال اين عمل نبايد موجب آسيب و در نتيجه كاهش فعاليت اجزاء سلولهاي گردد عمل سانتريفوژ كردن در دو مرحله انجام مي‌گيرد :
1 ) نوع ساده DiFFERENCIAL CENTIFU GATION
2 )‌جدا كردن به طريق هموژني ( ISOPICNIC )
كروماتوگرافي ( CHROMATOGRAPHY ) :

با كمك روشهاي كروماتوگرافي ملكولهاي مختلف بر اساس ويژگيهاي متفاوت خود نظير ملكول‌ها ( فيلترژله‌اي ) حلاليت در دو فاز ( كروماتوگرافي تقسيمي ) و بالاخره خصوصيات جذبي ( كروماتوگرافي جذبي ) از يكديگر جدا مي‌گردند . (3)
الكتروفورز ( ELECTROPHORESIS ) :
ملكولهاي داراي بارالكتريكي نظير اسيدهاي آمينه و پروتئينها در يك ميدان الكتريكي توجه به نقطه ايزوالكتريك خود با سرعتهاي متفاوت مهاجرت مي‌نمايد اين كيفيت را الكتروفورز مي‌گويند پس در اين روش ملكولهاي داراي بار الكتريكي بر حسب سرعت خود مشخص از يكديگر جدا مي‌گردند عمل الكتروفورز مي‌تواند در يك محلول بافر انجام مي‌گيرد غالباً براي محلول بافر كه نقش الكتروليت را دارند ناقل سختي نظير كاغذ لايه‌هاي نازك استات يازل پلي‌آكريل آميد ( Polyacrylamidgl ) انتخاب مي‌گردد در اينجا ملكولها نه تنها به علت بار الكتريكي متفاوتشان بلكه بر حسب اندازه و شكل ملكول‌هايشان جدا مي‌گردند هرچه وزن ملكولي بيشتر باشد حركت ملكول كندتر است ساختمان فضائي ملكولها نيز در حركتشان مؤثر است .
اساس كار به قرار زير است :
ژل جدا كننده با ژل يك ثانويه باروزنه‌هاي درشت پوشيده مي‌‌شود كه روي آن محلول مورد آزمايش منتقل مي‌گردد در ميدان الكتريكي ملكولها در ژل ثانويه مهاجرت مي‌نمايند و در مرز بين دو ژل در يك بخش نازك متمركز مي‌شوند در اينجا ملكولها در ژل جدا كننده ( اوليه ) بر طبق اندازه ملكولها و تحرك الكتروفورزي خود جدا مي‌گردند بين ژل جدا كننده ( اوليه ) و ژل جمع كننده ( ثانويه )، دو عامل غير هماهنگ PH و اندازه روزنه‌ها در دو ژل موجود مي باشند . (3)
فتومتري ( PHOTOMETRIE ) :
عده‌اي از اجزاء سلولي اين خاصيت را دارند كه امواج نوري با طول موجهاي معين را جذب نمايند و با اين كيفيت مي‌توان اين اجزاء را از نظر كيفي و كمي مورد مطالعه قرار داد . (3)

متد كشت سلول :
تكنيك كشت سلول يا بافت در بيوشيمي بيولوژي ملكولي فيزيولوژي سلولي ژنتيك، جنين شناسي، انگل شناسي، بافت شناسي و غيره به كار مي‌رود معمولي‌ترين سلولهايي كه كشت داده مي‌شوند سلولهاي باكتريها و سلولهاي بافتهاي پستانداران هستند براي كشت سلول بايد اول محيط كشت مناسب آن نوع سلول خاص تهيه گردد كه در آن عوامل منبع انرژي سلولها، امواج، عوامل رشد، اسيديته ( PH ) مناسب و حرارت مورد توجه قرار مي‌گيرند .

محيط كشت سلولهاي پستانداران پيچيده‌تر از محيط كشت مورد نياز سلولهائي نظير باكتريهاست در ابتداي كار كشت سلول اين‌طور معمول بود كه مخلوطي از سرم و عصارة جنين جوجه، به عنوان محيط كشت بكار برده مي‌شدند در سلولهاي اخير محيط كشت تركيبي درست شده كه محتوي تركيبات متعددي است بعنوان مثال مي‌توان محيط كشت تركيبي از آب، املاح و مواد معدني و محتوي متابوليتهاي زيادي باشد حتي امروزه عليرغم تركيبات پيچيده محيطهاي كشت تركيبي ب

ه طور معمول لازم است كه از سرم جنين يا سرم اسب و غيره بعنوان تكميل كننده محيط كشت كه باعث رشد سلول شود استفاده نمايند ساده‌ترين تكنيك براي مطالعه رشد سلولهاي پرندگان و پستانداران متد برداشت بافت است قطعه كوچكي از بافت را روي لاملي كه با قطره‌اي از پلاسماي جوجه و محيط كشت پوشيده است قرار مي‌دهند پلاسما سخت شده و منعقد مي‌گردد لامل بر روي يك لام گرد برگدانده مي‌شود به طوريكه بافت و پلاسما در سطح زيرين قرار گيرند اطراف لامل توسط پارافين مذاب با قلم‌مو كاملاً مسدود و كشت در محيط با حرارت مناسب نگهداري مي‌شود

.
كليه عمليات كشت سلول از قبيل تهيه محيط كشت و وسائل جراحي و محل نگهداري بافت بايد استريل شوند علاوه بر روش فوق روشهاي ديگري از كشت بافت و سلول وجود دارند كه طي آن سلولها را مي‌توان در بطري و يا در ظرف پتري و غيره بر حسب نوع تجزيه كشت داد . (4)

طرز قرار گرفتن بافت و محيط كشت با استفاد ه از لام مخصوص
بيولوژي سلولي و بيولوژي ملكولي

فصل دوم :

«ميكرو مور فولوژي سلول »

در اين قسمت به مطالعه ساختمان كلي و ميكروسكوپي ياخته‌هاي تغيير نيافته مي‌پردازيم مطالعه ساختمان شكلهاي تغيير يافته سلول بعداً مورد بحث قرار مي‌گيرد .
بخش اول مربوط به سلول جنيني ( مريستمي ) بعد سلول جانوري تغيير يافته واختصاصات آن وبالاخره ساختمان باكتريها و سيانو فسيه‌ها يعني نمونه‌هاي پروكاريوت مطالعه خواهند ( Prokaryotes ) البته بايد توجه داشت كه اين گروه از سلولها مثل يوكاريوتها ( Eucytes ) شامل بخش شبه هسته يا به اصطلاح نوكلئوتيد (Nucleoid ) پلاسما و ديواره مي‌باشند .

در سلولهاي گياهي ديواره سلولي گاه‌گاه بوسيله كانالهائي كه همان پلاسمودسماستا ( Plasmodesmata ) هستند قطع مي‌گردد در داخل غشاء سيتو پلاسم و در مركز آن هسته قرار گرفته كه در آن كروماتين و هستك ( نوكلئوس ) جاي دارند هسته با شبكه تور مانندي از جنس غشاء كه در تمام سلول كشيده شده و آندوپلاسميك رتيكولوم ( Endoplasmic Reticum ) خوانده مي‌شود احاطه مي‌گردد .
اين غشاء‌ها بعد از برش به شكل دو خط باريك در سلول جلب توجه مي‌كنند علاوه بر اينها

ارگانلهاي ديگر مانند ميتوكندريها، پلاستيدها، سيتوزومها، ديكتيوزومها ( مجموع آنها دستگاه گلژي را مي‌سازند ) ريبوزومها ( قسمتي از ER دانه‌دار ) واكوئلها و بالاخره اجزاء ذخيره‌اي نظير كريستال پروتئين قطرات چربي در آن ديده مي‌شوند ديكيتوزومها، ريبوزومها و شبكه آندوپلاسمي درون هيالوپلاسم ( بخش پلاسماي فاقد اندامك ) قرار دارند .
به استثناي پلاستيدها كه در گياهان سبز به وجود مي‌آيند بقيه اجزاء درون سلول در قارچها و در سلولهاي جانوري ( البته با تفاوتهائي ) هم وجود دارند واكوئلهاي بزرگي كه در سلولهاي گياهي وجود دارند پلاسمودسمها و تغييرات ديواره سلولزي از اختصاصات سلولهاي گياهي مي‌باشند برعكس سانتريولها در سلولهاي گياهان عالي ديده نمي‌شوند ولي در تمام سلولهاي جانوري همچنين در پروتوفيت‌هاي(Protophytes) دنياي گياهان وجود دارند و در ساختن دوكها و سيستم حركت مژه و تاژك ظاهر مي‌گردند .(3)
ساختمان ظريف سلول يوكاريوت
غشاء سيتوپلاسمي ( Unit Membrane ) :
سلول زنده خودش را در مقابل محيط به وسيلة غشايي محافظت نموده و قادر است با كمك آن تركيب محيط داخلي خويش را براي اعمال متابوليسمي مساعد نموده و اين تركيب را نيز حفظ نمايد .
اين غشاء با ضخامتي در حدود 5 تا 10 نانومتر در ميكروسكوپ الكتروني سه لايه‌اي به نظر مي‌رسد و با كيفيت ذكر شده سبب مي‌گردد كه مثلاً غلظت پتاسيم درون سلول در مقايسه با سطح خارجي غشاء اختلافي برابر 103 نشان دهد در حاليكه برخي از مواد جز به مقدار ناچيز در سلول وارد نمي‌گردند حتي اگر به مقدار فراوان در اختيار سلول قرار گيرند

.
بنابر اين وظيفة غشاء سلولي كنترل تبادل آزاد مواد و همچنين عضوي از انتقال مواد است كه با كمك آن موادي حتي در جهت عكس كيفيت انتشار وارد سيتوپلاسم و يا از پلاسما به طرف خارج سلول منتقل مي‌گردند .
به همين جهت ساختمان شيميائي و آنزيمي و نحوه عمل آن براي تحقيقات تراوائي و انتقال اهميت بسزائي دارد .
غشاء بيولوژيكي در مقابل انتشار مواد ليپوفيل مقاومتي

نشان نمي‌دهد حتي ملكولهاي درشت از اين دسته مواد مي‌توانند به راحتي از آن بگذرند در حاليكه عبور ملكولهاي هيدروفيل بستگي به اندازه آنها دارد .
هرچه ملكول هيدروفيل كوچكتر باشد عبور آن راحت‌تر انجام مي‌گيرد ( تأثير اوالترافيلتري غشاء ) مثال شناخته شده‌اي كه ويژگيهاي متفاوت غشاء‌هاي بيولوژيكي را در رابطه با قابليت تروائي غشاهاي زيستي نشان مي‌دهد تله‌يونهاي قرمز خنثي است قرمز خنثي ملكولهاي ليپوفيل درشتي دارد كه از غشاء بدون مانع مي‌گذرند و وارد واكوئل مي‌گردند در محتوي اسيدي واكوئل ملكولهاي قرمز خنثي يونيزه شده و توليد يونهاي هيدروفيل مي‌نمايند كه نمي‌توانند از غشاء عبور كنند يعني از واكوئل نمي‌توانند مجدداً خارج گردند و با ورود بيشتر قرمز خنثي به واكوئل و تجزيه آن مقدارش در واكوئل پيوسته افزايش مي‌يابد خصوصيات ديناميك غشاء سلول كه پيوسته در حال ترميم است با ساختمان متغيرغشاء واكنشهاي انتقال مواد از غشاء سلولي قابل تطبيق است. (4)
در كنار پلاسماي زمينه ( Hyaloplasma ) اين ساختمان مهمترين بخش هر سلول است غشاء تمام پروتوپلاسما را به فضاهائي تقسيم مي‌نمايند كه در آنها واكنش‌هاي مختلف در حال انجام هستند مثل هسته، پلاستيد‌ها ميتوكندريها، ديكتيوزومها، ليزوزمها و غيره . تمام اين اجزاء بوسيلة غشائي از جنس و ساختمان مشتركي شبيه غشاء سلول احاطه مي‌گردند . ( Unit Membrane ) و همين كيفيت انجام واكنشهاي كاملاً متضادي را درون سلول در كنار همديگر ممكن مي‌سازد علاوه بر اينها تعداد زيادي آنزيم پيوسته به غشاء فعاليت كنند كه اساس ساختماني عده زيادي از واكنشهاي بيوشيميائي را به وجود مي‌آورند غشاهاي بيولوژيكي با اين خصوصيات قابل مقايسه با غشا‌هاي مصنوعي كه غالباً براي مطالعه مكانيسم انتقال و كيفيت تراوائي غشاء مورد آزمايش قرار مي‌گيرند نيستند اين غشاء با ميكروسكوپ نوري قابل رؤيت نيست با وجود اين، وجود آنها مدتها قبل از اختراع ميكروسكوپ الكتروني مسلم بوده است .
با متدهاي غير مستقيم توانسته‌اند به ساختمان تقريباً دقيق غشاء پي ببرند اواخر قرن گذشته بعد از آزمايشهاي فراوان روي تراوائي غشاء‌ها به اين نتيجه رسيدند كه بخش اعظم غشاء‌هاي بيولوژيكي باسيت از ليپيد درست شده باشد چون كه مواد محلول در چربي به مراتب بهتر از غش

اء مي‌گذرند تا مواد محلول در آب. ملكولهاي چربيهاي ساختماني قابليت تجمع و ايجاد ساختمانهاي صفحه مانند را دارند از بين چربيهاي ساختماني فسفوليپيدها و گيليكوليپيدها از اهميت بيشتري برخوردارند اين ملكولها از گليسرين اسيدهاي چرب و اسيد فسفريك در گيليكوليپيدهد قند به وجود آمده‌اند از سه گروه OH مربوط به گليسرين در فسفوليپيد دو گروه OH با اسيدهاي چرب و سومي

با اسيد فسفريك پيوند مي‌خورد كه آخري بخش قطبي ملكول(آب دوست ـ Hydrophyle) را مي‌سازد در حاليكه زنجيرهاي هيدروكربور اسيدهاي چرب، بخش غير قطبي ( Hydrophobe ) آن را تشكيل مي‌دهند و به اين ترتيب از چربيهاي ذخيره‌اي كه تجمع توده‌ مانندي به وجود مي‌آورند ( Plasmoqlobuli = قطرات چربي = Oleusome ) مشخص مي‌گردند و در نتيجه اين كيفيت سطح فعال به وجود آمده توسط چربيهاي ساختماني زياد و در نزد چربيهاي ذخيره‌اي غير قطبي اندك خواهد بود .