بخشی از مقاله
بررسی پلی مورفیسم ژنتیکی (A2455G) ژن cyp1a1 در یک جمعیت مبتلا به سرطان تخمدان در استان مازندران
چکیده
سابقه و هدف: پروتئین(CytP450 1A1) CYP1A1 در متابولیسم طیف وسیعی از سوبستراهای داخلی و خارجی دخیل است و نقش مهمی در سرطانزایی هورمونها و زنوبیوتیکها ایفا میکند. ژنوتیپهای مختلف این ژن با افزایش ریسک ابتلا به سرطان ناشی از مواجهه با هورمونها و سموم آلوده کننده محیطی مرتبط هستند. در مطالعه حاضر پلیمورفیسم ژنتیکی سیتوکروم P450 در بیماران مبتلا به سرطان تخمدان در استان مازندران به روش PCR-RFLP ارزیابی گردیده است.
مواد و روش: تعداد 70 داوطلب سالم و 50 بیمار مبتلا به سرطان تخمدان که در طی فاصله زمانی مهرماه 93 تا فروردین 94 به مرکز تخصصی و فوق تخصصی طوبی واقع در شهرستان ساری مراجعه کرده بودند، نتخاب شدند. 5 میلی لیتر خون محیطی از هر فرد گرفته شد و در لولههای حاوی EDTA در فریزر با دمای -20 نگهداری شدند. استخراج DNA با روش فنل کلروفرم صورت گرفت و به وسیله روش PCR-RFLP پلی مورفیسم M1 در ژن cyp1a1 بررسی شد.
یافته ها: الگوهای بدست آمده حاصل از هضم آنزیمی تجزیه و تحلیل شدند و نتایج نشان داد که قطعه 332 جفت بازی واجد جایگاه +2455 اگزون شماره 7 که در مجموع از 50 بیمار مبتلا به سرطان تخمدان بدست آمده بود در %78 از بیماران دارای ژنوتیپ AA و %22 دارای ژنوتیپ AG بودند و همچنین در نمونههای کنترل 70 فرد سالم مورد بررسی برای 2 ژنوتیپ AA و AGبه ترتیب فراوانی 82 و 16 درصد مشاهده گردید.
استنتاج: در جمعیت مورد مطالعه، پلیمورفیسم ناحیه +2455 ژن cyp1a1 (پلی مورفیسم (M2 تنها دو نوع ژنوتیپ AA و AG مشاهده شد. بررسی آماری نتایج حاصل از مقایسه فراوانیهای ژنوتیپی نشان داد که در این جمعیت اختلاف معنی داری بین این دو ژنوتیپ در افراد سالم و بیمار وجود ندارد. نتایج نشان میدهد که هیچ رابطه آماری معنی داری بین ژنوتیپهای مختلف M2 ژن cyp1a1 و خطر ابتلا به سرطان تخمدان در استان مازندران وجود ندارد.
کلمات کلیدی: CytP450 ، CYP1A1 ، جمعیت استان مازندران ، پلی مورفیسم ، سرطان تخمدان
-1 مقدمه
سیتوکروم P450 که به عنوان یکی از مهمترین آنزیمهای مرحله اول سم زدایی شناخته میشوند، جز خانواده بزرگ آنزیمی هموپروتئینها میباشند. این آنزیمها که در موجودات مختلف از باکتری تا انسان یافت میشوند، وظیفه اصلی اکسیداسیون ترکیباتی نظیر سموم، چربیها و هورمونهای استروئیدی را بر عهده دارند. این آنزیمها در کنار وظیفه اصلی آنها که سم زدایی است گاه با تغییراتی که روی مواد سرطانزا اعمال میکنند موجب فعال شدن آنها
میگردند. مطالعات نشان داده شده است که در انسان 18 خانواده ژنی، 43 زیرخانواده، 59 ژن و 33 ژن کاذب برای این آنزیمها وجود دارد .(1) با وقوع جهش و پلیمورفیسم در این ژنها پاسخهای بالینی متفاوتی در افراد نسبت به مواد شیمیایی یکسان مشاهده میشود(.(2
تداخلات زیان آور بین سموم آلوده کننده محیطی و DNA ممکن است از طریق طیفی از مکانیسمهای دفاع بیولوژیکی تعدیل یابند که این مکانیسمها شامل ترمیم DNA، کنترل نقاط تنظیم چرخه سلولی و آنزیمهای پاک سازی زنوبیوتیکها میباشند. پاک سازی زنوبیوتیکها جهت حذف کارسینوژنها دارای اهمیت است و به صورت اولیه به وسیله هیدروکسیلاسیون انجام میشود و آنزیمهای CYP 450 در هیدروکسیلدار کردن نقش مهمی دارند. 2)و(18)(6
ژن cyp1a1 که به نام هیدروکربن هیدروکسیلاز هم شناخته میشود یکی از مهمترین آنزیمهای سیتوکروم P450 میباشد. این ژن روی کروموزوم شماره 5 انسان در کنار ژن کدکننده آنزیم مانوز فسفات ایزومراز در موقعیت 15q22-24 قرار دارد. این ژن به طول 5810 جفت باز دارای 7 اگزون و 6 اینترون میباشد. ترجمه این ژن از اگزون 2 شروع شده و پروتئینی با 512 آمینواسید حاصل میشود. این آنزیم در بافتهای غیر کبدی نظیر شش ها معده، روده کوچک، پروستات پستان و تخمدان بیان بالایی دارد .(7) رونویسی این ژن تحت تاثیر عوامل ژنتیکی، پلی مورفیسم ژنهای ساختاری و تنظیمی و عوامل محیطی تنظیم میشود. اتصال ترکیبات خارجی و آلایندههای محیطی از جمله بنزوپرین و هیدروکربنهای چندحلقهای به گیرندههای آریل هیدروکربن موجب تحریک رونویسی این ژن میشود. پلیمورفیسمهای متعددی برای این ژن شناخته شده که چهار فرم آن متداولتر است و پراکندگی این ایزوفرمها در اقوام و نژادهای مختلف متفاوت میباشد. M1 در ناحیه غیرکد کننده 3’UTR در نوکلئوتید +3801 واقع شده که در این پلیمورفیسم باز تیمین به سیتوزین تبدیل میشود. M2 در نوکلئوتید شماره +2455 اگزون شماره 7 قرار دارد که در این پلیمورفیسم باز آدنین به گوانین تبدیل شده و درنتیجه در کدون شماره 462 اسید آمینهی ایزولوسین به والین تبدیل میشود. این جهش در جایگاه فعال آنزیمی یعنی محل اتصال گروهِم قرار دارد و باعث میشود که این فرم ژنی نسبت به فرمهای دیگر طول عمر و فعالیت بیشتری داشته باشد. M3 در ناحیه غیر کدکننده 3′ در نوکلئوتید 3205 میباشد که باز تیمین به سیتوزین تبدیل میگردد؛ و در نهایت M4 در نوکلئوتید 2453 است که باز سیتوزین به آدنین تبدیل شده و در کدون 461 اسید آمینه ترئونین به آسپارتات تبدیل میشود .(10-8)
پراکندگی ژنوتیپی در نژادهای مختلف متفاوت است و ژنوتیپهای متفاوت میتوانند عملکرد آنزیم را تغییر دهند. گزارشات نشان میدهد که در میان آسیاییها پلیمورفیسم M1 و M2 رایجترین اَشکال پلیمورفیسم این ژن هستند .(9)
انجام این تحقیقات بر روی بیماران سرطانی و ارزیابی ارتباط بین پلیمورفیسم ژن ذکر شده با هر کدام از انواع سرطان میتواند راهنمایی در جهت پیشگیری، درمان و کاهش سمیت داروهای مورد استفاده باشد. هدف از انجام مطالعه حاضر این بود که پلی مورفیسم M2 از ژن cyp1a1 را در یک جمعیت سرطانی و سالم از مردم استان مازندران مورد بررسی قرار دهیم.(11و.(12
-2 مواد و روش
در این تحقیق توصیفی-تحلیلی، تعداد 70 داوطلب سالم و 50 داوطلب بیمار غیر خویشاوند مقیم استان مازندران که در فاصله زمانی مهرماه 1393 تا فروردین 1394 به مرکز تخصصی و فوق تخصصی طوبی واقع در شهرستان ساری مراجعه کرده بودند، انتخاب شدند. کلیه داوطلبان قبل از ورود به مطالعه، فرم رضایت نامه استاندارد تدوین شده را امضا کردند. نمونه گیری از افراد و تکمیل فرم ثبت اطلاعات با در نظر گرفتن شرایط بومی بودن نداشتن سوابق بیماری مزمن نظیر مولتیپل اسکلروزیس، نارسایی قلبی، سرطان ، افسردگی و ... برای افراد سالم با نظارت پزشک به انجام رسید. 5 میلی لیتر از خون از محیطی هر فرد گرفته شد و در لولههای حاوی ماده ضد انعقاد خون EDTA به فریزر با دمای 20- منتقل شد.((15-13
-1-2 استخراج DNA ، توالی پرایمرها و واکنش PCR
استخراج DNA ژنومی از لنفوسیت نمونههای خون محیطی با استفاده از روش فنل کلروفرم انجام شد. این روش شامل چهار مرحله لیز سلولی پروتئین زدایی، رسوب DNA و آبگیری میباشد.(21و(22
-2-2 واکنش PCR-RFLP1
برای شناسایی پلی مورفیسم نوکلئوتیدی A2455G ، آغازگرهای اختصاصی طراحی و توسط شرکت Bioneer کره سنتز شدند. توالی این آغازگرهای اختصاصی به همراه طول قطعهی تکثیر شونده توسط آنها را میتوانید در جدول 1-2 مشاهده کنید.
جدول .1-2 توالی آغازگرهای اختصاصی استفاده شده برای واکنش زنجیرهایی پلیمراز
مخلوط PCR شامل 3 ماکرولیتر DNA استخراج شده، 0,8 ماکرولیتر dNTPs ، 1 ماکرولیتر MgCl2، یک یونیت آنزیم 3 Taq DNA Polymeras ماکرولیتر بافر PCR 10X ، 0,7 ماکرولیتر از هر دو پرایمرها میباشد و در نهایت با اضافه کردن آب مقطر استریل حجم نهایی را به 30 ماکرو رساندیم. برنامه PCR در برنامه ترموسایکلر عبارت است از: 5 دقیقه در دمای 95 درجه جهت تک رشتهای شدن اولیه سپس 30 سیکل دمایی شامل 40 ثانیه در 95 درجه جهت تک رشتهای شدن کلی، 40 ثانیه در 55 درجه جهت اتصال آغازگر، 45 ثانیه در 72 درجه جهت سنتز DNA و در نهایت 10 دقیقه در دمای 72 درجه جهت تکمیل سنتز .DNA سپس قطعات تکثیر شده بر روی ژل آگارز 1,5 درصد و با رنگ آمیزی اتیدیوم بروماید زیر نور UV مشاهده شدند (شکل 1-2 را مشاهده کنید) 19).(10)و(20
شکل :1-2 الکتروفورز محصول حاصل از تکثیر 332 جفت بازی اگزون 7 ژن cyp1A1 در ژل آگارز 1,5 درصد. چاهک :M مارکر 100 جفت بازی شرکت سیناژن، چاهک 1 تا 10 محصول تکثیر یافته تعدادی از نمونههای بیمار و سالم
-3-2 تعیین ژنوتیپ
تعیین ژنوتیپ با استفاده از تکنینک PCR-RFLP صورت گرفت. به محصولات PCR آنزیم NcoI اضافه شد و در دمای 37 درجه به مدت 16 ساعت انکوبه شد. سپس قطعات هضم شده روی ژل آگارز 2,5 درصد الکتروفورز شدند و با رنگ آمیزی اتیدیوم بروماید زیر نور UV بررسی شدند. قطعات بدست آمده از ژنوتیپ هموزیگوت GG قطعات 263 و 70جفت بازی و ژنوتیپ هتروزیگوت AG قطعات 232و 263 و70 و13ژنوتیپ وحشی AA قطعه 232 و 70 و 31 جفت بازی میباشند (شکل.(2-2
