بخشی از مقاله
شناسايي مورفولوژيکي و مولکولي قارچ Colletotrichum gloeosporioides عامل بيماري سوختگي شاخ و برگ کاج مطبق در ايران
چکيده
کاج مطبق A. excelsa( Araucariaheterophylla) از سوزني برگان است که به دليل کاربردهاي زينتي توجهات زيادي را به خود جلب کرده است . در طول تابستان و پاييز ٩١-١٣٩٠ نشانههايي از يک بيماري جديد در نواحي مختلفي از استان مازندران مشاهده شد. علائم بيماري ابتدا به صورت لکههاي ريز قهوه اي روشن تا تيره نامنظم بر روي برگها و پس از توسعه بر روي ساقه نيز ديده شد. پس از مدتي با پيشرفت بيماري نواحي آلوده خشک مي شوند. براي جدا سازي عامل بيماري، قطعاتي از بافت گياه ، حدفاصل نواحي آلوده و سالم ، پس از ضدعفوني روي محيط سيبزميني – دکستروز- آگار قرار داده شدند. قارچي مشابه Colletotrichum براساس خصوصيات مورفولوژيکي از نواحي آلوده جداسازي شد. نواحي ITS( rDNA internal transcribed spacer) به وسيله پرايمرهاي ITS٤ و ITS٥ تکثير و محصولات PCR توالييابي شدند. طول قطعات تکثيري bp ٥٤٩ بود. توالي بدست آمده با ديگر تواليهاي مربوط به همان ناحيه دربانک ژن مقايسه گشت . آناليز بلاست شباهتي ٩٩ درصد را با توالي .GenBank accession no)Colletotrichum gloeosporioides (JN١٩٨٤٢٩١ نشان داد. تست بيماريزايي به وسيله قراردادن قرصهايي از کشت ٥ روزه ايزوله شناسايي شده روي محيط PDA در سطح شاخههاي سالم انجام و بيماريزايي آن تاييد شد. اين اولين گزارش از شناسايي قارچ Colletotrichum gloeosporioidesبه عنوان عامل بيماري بر روي قارچ مطبق در ايران است .
کليد واژه : بيماري قارچي ، Araucaria excelsa ،ITS
مقدمه
کاج مطبق A. excelsa( Araucariaheterophylla) از خانواده اشکوبيان (Araucariaceae)، هميشه سبزي از راسته کاجيان (Pinales)، رده ناژويان (Pinopsida)، گروه مَخروطيان (Coniferae يا Pinophyta)هستند. زيستگاه اصلي کاج مطبق جزيره نورفولک استراليا است . رشد آن در محيط طبيعي زياد ولي در آپارتمان به کندي رشد ميکند، احتياج به اکسيژن فراوان دارد و درجه حرارت بالا را تحمل نميکند ( ١ .در تابستان گرما را تا ٤٠ درجه تقريباً تحمل ميکند ولي در زمستان تحمل يخبندان را ندارد. درختان با تنه عمودي و شاخه هاي متقارن و حد اکثر تا ٥٠ تا ٦٥ متر رشد مي کنند. اين کاج به خاطر شکل زينتي زيبايش بسيار مورد پسند دوستداران گل و گياه قرار دارد. اين ارقسام را تا جوان و کوتاه هستند ميتوان درگلدان کاشته براي زينت سرسراي عمارات و سالنها از آن استفاده کرد (٢). در طول تابستان و پاييز ٩١-١٣٩٠ نشانه هايي از يک بيماري جديد در نواحي مختلفي از استان مازندران مشاهده شد. علائم بيماري ابتدا به صورت لکه هاي ريز قهوه اي روشن تا تيرهنامنظم بر روي برگهاي سوزني و از طريق آن به ساقه نيز سرايت مي کند. پس از مدتي با پيشرفت بيماري
نواحي آلوده خشک شد.نتيجه اين بررسي منجر به شناسايي قارچ Colletotrichum gloeosporioides به عنوان عامل بيماري سوختگي شاخ و برگ کاج مطبق گرديد . نتايج اين بررسي از سويي ميتواند به حفظ اين گياه زينتي در مقابل اين بيماري مخرب کمک نمايد .
مواد وروش ها:
- جداسازي وکشت قارچ :
نمونههاي آلوده از نقاط مختلف استان مازندران جمعآوري و به آزمايشگاه منتقل شدند. براي جداسازي قارچ قطعات آلوده به اندازه ٠.٥-١ سانتيمتر برش داده شدند و پس از ضدعفوني سطحي در پتري حاوي محيط کشت WA ( واتر-آگار )در دمايCْ◦٢٥-٢٠ کشت داده شد ند،پس از رشد قارچ خالص سازي در محيط PDA (سيب زميني ـ دکستروزـ آگار) انجام گرديد. قطعه اي از ميسليوم جدايه خالص شده را به محيط مايع PDB (سيب زميني ـ دکستروز) منتقل وبر روي دستگاه لرزاننده با rpm١٢٠ قرار داده شد.
- استخراج DNA :
توده ميسيليومي رشد کرده در محيط PDB با آب مقطر شستشو داده سپس با ازت مايع C◦٨٠ – پودرگرديد، ٨٠٠ ميکرو ليتر بافر استخراج mM( CTAB٢٠ mM,EDTA١٠٠ M,Tris-HCL ١.٤ Nacl و٪CTAB٢)بر روي آن اضافه شد. ومخلوط حاصل به ميکرو تيوب ١.٥ميلي ليتر منتقل شد وپس از ورتکس به مدت ٣٠ دقيقه در دماي C◦٦٥در حمام بنماري قرار داده
