بخشی از مقاله
چکیده
نقطه شروع بسیاري از روشهاي بیولوژي مولکولی، ضرورت جداسازي DNA با کیفیت عالی است. معمولا کیفیت DNA با عواملی از قبیل عدم آلودگی ناشی از RNA، پروتئین، لیپید و سایر ساختارهائی که براي آنزیمهاي برشی و پلی مرازها مزاحمت ایجاد میکنند سنجیده میشود. معمولا DNA استخراج شده از بلوك هاي پارافین و بافتهاي فیکس شده در فرمالین بخاطر اثرات تخریبی وارد شده بر DNA، از کیفیت مطلوبی برخوردار نیستند. هدف از مطالعه، معرفی روش کارآمد در استخراج DNA از بافتهاي نگهداري شده در فرمالین میباشد. جهت استخراج DNA از بافتهاي نگهداري شده در فرمالین، دو پروتکل مختلف از کیت Bioneer و کیت طراحی شده General Genomic Extraction توسط نویسندگان مقاله مورد مقایسه قرار گرفتند. ارزیابی کمی و کیفی بر روي DNA هاي استخراج شده انجام گرفت. جهت تایید و ارزیابی DNA استخراج شده، واکنش PCR با پرایمرهاي ژن بتاگلوبین بر روي تمام نمونه ها انجام شد. نتایج آزمایش کیفی و کمی نشان داد که DNA استخراج شده با استفاده از کیت General Genomic Extraction از کمیت و کیفیت مطلوبتري در مقایسه با کیت Bioneer برخوردار بود. میزان تکثیر نمونه ها با پرایمر بتاگلوبین، حاکی از غلظت و خلوص بیشتر DNA استخراج شده با کیت مذکور در مقایسه با کیت Bioneer بود. با توجه به آسیب ناشی از نگهداري بافت در فرمالین، کیت General Genomic Extraction کارایی بیشتري در استخراج DNA داشت. این روش میتواند براي استخراج DNA از بافتهاي نگهداري شده در فرمالین و بلوكهاي پارافین به صورت روتین در آزمایشات تحقیقاتی و بالینی مورد استفاده قرار گیرد.
واژگان کلیدي : استخراجDNA، بافت، فرمالین
مقدمه
پیشرفت در هر رشته علمی به در دسترس بودن تکنیکها و روشهاي جدید و کارآمد در آن رشته بستگی دارد. در سالهاي اخیر با پیشرفت روشهاي سلولی و مولکولی، در اکثر آزمایشگاههاي معتبر دنیا آزمایشاتی براي جدا کردنDNA ژنومی جهت پی بردن به سکانس و عملکرد آن انجام میشود . امـروزه مبـاحث ملکولی از اهمیت روز افزونی در بررسیهايعلوم زیستی برخوردار میباشد. استخراج DNA ژنومی خالص، پایدار و با کمیت و کیفیت مناسب، اولین و مهمترین گام در بسیاري از تحقیقات بیولوژیکی و ژنتیکی به ویژه در واکنش(RFLP)، تکنولوژي توالییابی ژنومی، تعیین ژنوتیپ افراد و شناسایی موتاسیونها میباشد .(9)
نقطه شروع بسیاري از روشهاي بیولوژي مولکولی، ضرورت جداسازي DNA با کیفیت عالی است. معمولا کیفیت DNA با عواملی از قبیل عدم آلودگی ناشی از RNA، پروتئین، لیپید و سایر ساختارهائی که براي آنزیمهاي برشی و پلی مرازها مزاحمت ایجاد میکنند سنجیده میشود 1)و .(4
بسیاري از تحقیقات و مطالعات بالینی بر روي بافتهاي ثابت شده در فرمالین و یا تهیه شده در قالب پارافین انجام میگیرد. از مزایاي این نمونه ها میتوان به دسترسی آسان به گنجینه غنی از نمونه هاي بالینی در سالیان متوالی اشاره کرد. از سویی، جهت انجام تحقیقات مستمر و متوالی بستر مناسبی براي محققین فراهم میباشد.
به علت بزرگ بودن اندازه DNA ژنومی در پستانداران، روشهاي استخراج DNA باید حداقل استرس مکانیکی را در طی استخراج ایجاد نمایند. از طرفی مشکلاتی نیز در خصوص استفاده از بافتهاي ثابت شده نسبت به بافتهاي تازه وجود دارد که از آن جمله میتوان به شکست DNA به قطعات کوچکتر و تجزیه شدن DNA اشاره کرد. بنابراین بهینه سازي و انتخاب روش استخراجی که کمترین آسیب را به DNA اینگونه بافتها برساند از اهمیت بالایی برخوردار است .(6) یکی از مشکلات اساسی در استخراج DNA از اینگونه بافتها، وجود پیوندهاي قوي بین پروتئین و DNA میباشد که بایستی در طیپروسه استخراج شکسته شوند .(14) همواره مطالعات و تحقیقات متعددي در دنیا با هدف به حداقل رساندن آسیبهاي DNA طی فرآیند استخراج در حال انجام است. در این راستا، روشها و کیتهاي متعددي توسط شرکتهاي مختلف عرضه میشوند که معمولا گرانقیمت هستند و بعضی حتی بازده مناسب ندارند. هدف از این تحقیق، بررسی مقایسهاي کمیت و کیفیت DNA استخراج شده توسط کیت بیونیر (Bioneer) وکیتGeneral Genomic Extraction (GGE) ابداع شده توسط نویسندگان میباشد.
مواد و روش کار
نمونه برداري
در این مطالعه، نمونه هاي بافتی شامل آدنوکارسینوماي کلورکتال قرار گرفته در فرمالین از بخش پاتولوژي بیمارستان امام خمینی تهیه شدند.
استخراج DNA بر اساس کیت Bioneer
استخراج DNA بر اساس روش کیت استخراج Bioneer (شرکت بیونیر کره جنوبی) انجام شد.
استخراج DNA بر اساس کیت General Genomic Extraction (GGE)
کلDNA سلولی بر طبق دستورالعمل کیت General(شرکت زیست دانش یاران)،استخراج شد. بطور خلاصه، 0/05 گرم از بافتهاي مورد بررسی با تیغ اسکالپل خرد شدند و با بافر لیز کننده (Solution A) مخلوط شدند، سپس 30 میکرولیتر پروتئیناز (20 mg/ml ) K، به مخلوط اضافه شد و بمدت 3 ساعت در دماي 65˚C انکوبه شدند. میکروتیوپها هر 15 دقیقه یکبار وارونه شدند. 6 میکرولیتر از Binding Buffer (Solution B)به مخلوط اضافه شد و در 12000 rpm بمدت 5 دقیقه سانتریوفوژ شدند. فاز رویی جدا شد. این مرحله دوباره تکرار شد. فاز رویی به میکروتیوپهاي جدیدي انتقال یافت. 6 میکرولیتر از بافر رسوب دهنده (Solution C) اضافهشد و بمدت 20 دقیقه وارونه شدند. نمونه ها بمدت 10 دقیقه در 12000 rpmسانتریوفوژ شدند و فاز رویی دور ریخته شد. رسوب DNA با بافر شستشو دهنده (Solution D) شستشو داده شد و سپس در 12000 rpm بمدت 10 دقیقه در 4˚C سانتریوفوژ شد. رسوب DNA در دماي 37˚C خشک شدند.
بررسی کیفیت و کمیت DNA
براي بررسی کیفیت DNA هاي استخراج شده با دو روش، از ژل آگارز %1 رنگ آمیزي شده با ژل رد استفاده شد. جهت تعیین کمیت و کیفیت DNA استخراج شده از نانودراپ NanoDrop™ ND-2000 با اندازهگیري میزان جذب نوري 260/230 nm و 260/280 nm غلظت DNA، خلوص و آلودگی پروتئینی DNA استخراج شده تعیین شد.
PCR ژن بتاگلوبین به عنوان کنترل
واکنش PCR در حجم نهایی 25 µl شامل، 12/5 µl بافر آمپلیکون، 0/4) 0/5 µl میکرومولار) از پرایمر اختصاصی ژن
بتاگلوبینGH20 (5' GAA GAG CCA AGG ACA GGTAC 3')، PC04 (5' CAA CTT CAT CCA (CGT TCA CC3'، 50 ng از DNAنمونه هاي استخراج شده، جهت اثبات استخراج DNA از نمونه ها انجام شد. تکثیر DNA با استفاده از دستگاه ترموسایکلر (Bio Rad PCR System, USA) مطابق برنامه دمایی مرحله دناتوراسیون ابتدایی در 95˚C به مدت 3 دقیقه، 45 چرخه اتصال پرایمر شامل اعمال دماي 95˚C به مدت 30 ثانیه، دماي 53˚C به مدت 40 ثانیه و دماي 72˚C به مدت 40 ثانیه صورت گرفت و در پایان مرحله گسترش نهایی پرایمر با اعمال دماي 72˚C به مدت 5 دقیقه انجام گردید. محصولات PCR، پس از رنگ آمیزي با gel red بر روي ژل آگارز 2٪ در تانک الکتروفورز حاوي بافر (Boric acid, Na EDTA, Deionized WaterTris Base, ) TBE با ولتاژ 100V به مدت 1 ساعت مورد بررسی کیفی قرار گرفتند که نتایج به وسیله دستگاه ژل داك و با اشعه UV مشاهده گردید.
نتایج
کیفیت و کمیت DNA استخراج شده از هر نمونه با الکتروفورز ژل آگارز 1٪ و سنجش نانودراپ بررسی شد. میزان جذب نوري 260/280 توسط کیت Bioneer در محدوده 0.06-1.8قرار داشت در حالیکه همین جذب نوري توسط کیت GGE بین 1.8-2 محاسبه شد. در بررسی غلظت DNA استخراج شده نیز کیت GGE نتایج بهتري داشت، بطوریکه میزان غلظت DNA هاي استخراج شده بین 124-3500 ng/μl برآورد شد در حالیکه غلظت DNA استخراج شده توسط کیت Bioneer بسیار پایینتر بود .(1.01-23.78)
کیفیتDNA استخراج شده با دو کیت مورد نظر در نگاره 1 و 2 ارائه شده است. در نگاره 1، کیفیت DNA استخراج شده با کیت Bioneer و در نگاره 2، کیفیت DNA استخراج شده با کیت GGE نمایش داده شده است. همانطور که مشاهده میشود DNA استخراج شده با کیت Bioneer از کیفیت مناسبی برخوردار نیست و بسیار شکسته شده و حالت اسمیر دارد
