کارآموزی تهیه واکسن در مؤسسه راضی

بخشی از مقاله

تاریخچه
مؤسسه تحقیقات واکسن و سرم سازی با بیش از 75 سال سابقه فعالیت یکی از قدیمی ترین و معتبرترین مراکز علمی و تحقیقاتی کشور شناخته می شود.
این مؤسسه فعالیت خود را در سال 1304 تحت وزارت فلاحت و فوائد عامع (وزارت کشاورزی وقت) با تحقیقات پیرامون راههای مبارزه با بیماری خانمانسوز طاعون گاوی که با تلف صدها هزار رأس گاو حیات دامی کشور را مورد تهدید قرار داده بود آغاز مرد و پس از مدت کوتاه با تولید و عرضه واکسن مؤثر علیه بیماری مبور دوره نوینی از مبارزه علیه بیماریها را در کشور پایه گذاری نمود.

به فاصله کوتاهعی پس از این موفقیت کاربر روی تولید واکسنهای مؤثر علیه بیماریهای مهلک دامی از قبیل سیاه زخم نیز آغاز شد و از سال 1320 تحقیق و تولید انواع واکسنها و سرمهای ممصرف پزشکی در دستور کار مؤسسه تحقیقات رازی قرار گرفت.
مسئله ای که حائز اهمیت می باشد این است که دوران شکوفائی و رشد و توسعه مؤسسه تحقیقات رازی مربوط به دوران پس از واگذاری مدیریت مؤسسه به متخصصان داخلی در سال 1329 می باشد و خوشبختانه بخش عمده ای از واکسنها و دیگر فرآورده های بیولژیک در این سالها مورد تحقیق و تولید قرار گرفته اند.
در سالهای پس از انقلاب اسلامی روند فعالیت ها در مؤسسه تحقیقات رازی از لحاظ کمی و کیفی گسترش چشمگیری پیدا کرد بطوریکه تحقیق و تولید زایدی از واکسنهای دامی و انسانی از جمله واکسنهای اوریون، سرخجه و سه گانه (سرخک، سرخجه، اویون) در این سالها انجام گرفت.

تحقیق
در سالهای اخیر فعالیتهای گسترده ای برای تحقیق و تولید انواع مختلفی از واکسنهای نصرف انسانی، دام و طیور تداوم پیدا کرده و به یمن تلاشهای تعداد زیاد از متخصصان و دانشمندان کشورمان قابلیت های علمی و تحقیقاتی مؤسسه از شهرت جهانی برخوردار شده است.
تولید
با توجه به برنامه ریزی گسترده جمهوری اسلامی ایران برای مقابله با بیماری های ا

نسان، دام و طیور مؤسسه رازی تولید انواع واکسنها و آنتی ژنها را در دستور کار خود قرار داده است. واکسنهای جدید علیه بیماری لپتوسپیروز و اوریون و برخی آنتی ژنها از قبیل لکتین، گامبور، نیوکاسل روغنی طیور و واکسن آنفلونزای روغنی طیور تولید شده است.

تشخیص
در حال حاضر معاونت تشخیص مؤسسه با در اختیار داشتن آزامایشگاههای مجهز در زمینه تشخیص بیماریها میکروبی و ویروسی تشخیص پاتولژی و انگل شناسی و همچنین ت

شخیص بیماریهای آزیان، زنبور عسل و کرم ابریشم خدمات بیشماری را به سازمان دامپزشکی و مراکز تحقیقاتی و دانشگاه ها ارائه می دهد.

تعلیم
مؤسسه رازی با بهره گیری از تعداد قابل توجهی اعضای هیئت علمی و یک سلسله امکانات فنی و تجهیزاتی گسترده و کمیاب بسیار خوبی برای برگزاری دوره های آموزش ضمن خدمات و دوره های مقطع دار برخوردار است. همچنین تعدادی دانشجوی دوره های فوق لیسانس در رشتهخ های ویروس شناسی و باکتری شناسی در مؤسسه مشغول به تحصیل هستند.

توسعه
در حال حاضر مؤسسه رازی بر روی تولید واکسن برخی بیماری های انسانی از جمله واکسن هموفیلوس واکسن آنفولونزا، واکسن آسلولار، سیاه سرفه مصرف انسانی و واکسن نوترکیبی تب برفکی دام و تولید انواع آنتی ژن ها و کیت های تشخیصی آزمایشگاهی گامهای بلندی در جهت بهره گیری از بیوتکنولوژی که بعنوان یکی از پنج علم برتر جهان محسوب می شود، برداشته است.

جایگاه بین المللی
مؤسسه تحقیقات واکسن و سرم سازی رازی سالیانه بیش از سه میلیارد (دز) انواع ف

رآورده های بیولوژیک از جمله واکسن و سرمهای مختلف مصرف پزشکی، دامپزشکی و آنتی ژن های تشخیص آزمایشگاهی به عنوان یکی از بزرگترین مؤسسات نوع خود در جهان و بی نظیر در سطح خاورمیانه شناخته می شود.
این مؤسسه دارای ارتباطات گسترده با مجامع شناخته شده بین المملی از جمله سازمانهای بهداشت و خواربار جهانی می باشد و از سوی دفتر مبارزه با بیماریهای واگیر دامی (م

ستقر در پاریس) به عنوان آزمایشگاه مرجع بین المللی برای تشخیص برخی از بیماریها از جمله آبله بزی، آبله گوسفندی و طاعون گاوی معرفی شده است. این مسئله نشان بارزی از اهمیت جایگاه مؤسسه تحقیقات رازی در عرصه بین المللی می باشد. در حال حاضر کتابخانه و مراکز اسناد علمی و تحقیقاتی مؤسسه رازی به عنوان یک کتابخانه مرجع تخصصی در زمینه بیماریهای انسان، دام و طیور که دارای حدود هجده هزار جلد کتاب ارزشمند و ده ها هزار مجله و ژورنال خارجی

است، که از اکثر مراکز علمی و تحقیقاتی معتبر جهان جمع آوری می گردد با فراهم آوری و سازماندهی منابع و بکارگیری سایت اینترنت و بانکهای اطلاعاتی جهان و تبادل اطلاعات با مراکز علمی و معنبر بین المللی الز جمله WHO , OIE, FAO, UNICEF, UNESCO نسبت به فراهم آوری آخرین منابع اطلاعاتی روز و تکنولوژی های پیشرفته نقش بسزایی در تأمین اطلاعات علمی و ارتباطات محققین و پژوهشگران مؤسسه رازی و سایر مراکز علمی و تحقیقاتی کشور را ایفا می نماید.

فرآورده های مصرف پزشکی
.اکسن فلج اطفال
واکسن سرخک
واکسن اوریون (ضد گوشک)

واکسن ام ام آر (سرخک، سرجه، اوریون)
واکسن دوگانه (ضد دیفتری، کزاز)
برای خردسالات، نوجوانان و بزرگسالان
واکسن سه گانه (ثلالث)
ضد دیفتری، کزاز و سیاه سرفه
واکسن کزاز
سرمهای درمانی مصرف پزشکی
سرم ضد کزاز

سرم ضد دیفتری
سرم پلی والام ضد عقرب
سرم پلی والان مار

واکسن مصرف دامپزشکی
- شاربن (سیاه زخم)
- توام شاربن و کزاز است

توبر کولین
الف) محلول توبر کولین مرغی
ب) محلول توبر کولین انسانی
ج) محلول توبر کولین پستانداران (بورت- تمبر توبرکولین)

قسمت فیریکوشیمی
قسمت فیزیکوشیمی وابسته به بخش کنترل کیفیت می باشد.
کنترل کیفیت یکی از مهمترین قسمتهای مؤسسه رازی در تأکید محصولات تولیدی می باشد.
این بخش همانطور که در چارت مشاهده می کنید شامل 5 قسمت زیر می باشد:
1- Phisicochemistry department
2- Pathology and under test animal department
3- Microbiology department
4- Immunopharmacology department
5- Gent cell bank
قسمت فیزیکوشیمی در واقع کارهای شیمی مربوط به کنترل کیفیت را به عهده دارد. این قسمت همانطور که مشاهده می کنید وظایف گوناگونی را عهده دار میباشد:
1- Raw material release

یکی از کارهای اصلی قسمت فیزیکوشیمی تأئید کرد

ن موارد اولیه می باشد.
2- Analytical tests

تستهای تجزیه ای، یکی از کارهای عمومی و در واقع جز کارهای روتین در این آزمایشگاه می باشد. مثلاً اندازه گیری کمی میزان مواد سمی موجود در هر واکسن یکی از کارهای این بخش می باشد که از جمله تستهای تجزیه ای می باشد.
3- In process testing
مسئله مهمی که در تولید واکسن و سرم وجود دارد تستهای حین تولید می باشد و بررسی اینکه چه مقدار ماده در تولید یک محصول وجود دارد، کار بسیار مهم و ح

ساسی است خاصه اینکه محصول مورد نظر استفاده انسانی و دامی می رسد.
4- Environmental monitoring
5- Water systems

آب مقطر 1 بار و آب مقطر 2 بار تقطیر شده یکی از اساسی ترین نیازهای هر بخش می باشد، در بخش فیزیکوشیمی با توجه به نیاز زیاد به آب مقطر یک بار تقطیر شده که بیشر برای شستشوی ظروف آزمایشگاهی مورد نیاز است و آب مقطر دوبار تقطیر شده که برای انجام تستهای آزمایشگاهی مورد نیاز می باشد. لزوم داشتن سیستم آب مقطر با توجه به استفاده زیاد این بخش برای آب مقطر معلوم می شود.

فصل دوم
تأیید مواد اولیه
تعیین آمینونیتروژن آزاد
تعیین تیپ شیشه
تست در پوشها

تایید موارد اولیه
یکی از کارهای روتین در آزمایشگاه فیزیکوشیمی تایید مواد اولیه خریداری شده می باشد. برای نمونه در یک نمونه تازه خریداری شده برای اطمینان از درصد آمینو نیتروژن آزاد تست های کنترل صورت می گیرد.
شیشه ها و درپوشهای مورد استفاده برای محصولات بایستی حتماً از نظر بی اثر بودن بر روی محصول بررسی شود چرا که این موضوع از جهت سالم بودن محصول و بی ضرر بودن آن و همچنین در بعضی مواقع از نظر اقتصادی بسیاری حائز اهمیت می باشد .
تعیین آمینو نیتروژن آزاد

نمونه را بین 5/0 – 1 گرم وزن می کنیم به آن 100 سی سی آب مقطر 2 بار تقطیر شده اضافه می کنیم ( pH را با سود یا HCI 1/0 نرمال روی 7 تنظیم می کنیم ) .
سپس 40 سی سی فرم آلدهید 37/0 که pH آن را روی 7/8 تنظیم کرده ایم اضافه می کنیم ( با سود 1/0 نرمال یا HCI 1/0 نرمال ) سپس در حال زدن به آن سورد 1/0 نرم

ال اضافه می کنیم نقطه پایانی زمانی است که pH به 7/8 برسد حجم سود مصرفی را یادداشت می کنیم سپس 10 سی سی فرم آلدهید اضافه می کنیم . اگر pH کم شد مجدداً سود اضافه می کنیم و حجم سود مصرفی را به حجم قبلی اضافه می کنیم .
تست تعیین تیپ شیشه
شیشه های دارای انواع مواد می باشند ولی عموماً شامل مواد برسیلیکاتی است که هر چه مواد ناخالص در شیشه کمتر باشد بهتر است .
شیشه های تیپ یک برای فرآورده های انسانی مورد استفاده قرار می گیرند . و شیشه های دیگر نیز برای سایر فرآورده های مورد استفاده قرار می گیرند .

اگر مواد ناخالص در شیشه ها باشد ممکن است در اپر زیاد ماندن در شیشه ها ، شیشه ها ، یکسری مواد را به محتوای داخل شیشه پس می دهد و باعث تغییر ماهیت ماده می شود پس می بینیم که دانستن تیپ شیشه برای استفاده از شیشه مورد نظر برای فرآورده های مشخص بیسار مهم می باشد .
این تست در آزمایشگاه فیزیکوشیمی به چند روش انجام می گیرد که ما فقط یه یکی اکتفا می کنیم .
اندازه گیری مقدمت هیدرولیکی پودر شیشه برای تعیین تیپ شیشه انجام

تست B برای تعیین تیپ شیشه
مواد:
استوان
آب مقطر فاقد کربن دی اکسید
میتل رد
سدیم هیدروکسید
اتانول 96%
روش کار
شیشه های مورد آزمایش را با آب مقطر آبکشی نمائید
سپس آن ها را در وان پا نور خشک کنید
در حدود 100 گرم از شیشه ها را که حداقل شامل سه عدد شیشه شور را خرد کنید با استفاده از چکش بنحویکه حداکثر اندازه قطعات آن از 25 میلی متر بیشتر نباشد .
آن ها را به دستگاه خرد کننده منتقل کنید .
خرده های شیشه را روی mesh بریزید .
خرده های شیشه ها را از روی mesh 710 و 425 عبور دهید .
خرده هایی را که روی این دو mesh باقی می ماند را مجدداً خرد کنید .
بسرعت شیشه ها را الک کنید .
خرده هایی را که از mesh 710 . 425 بدست می آید را بیشتر خرد منید
مش را به صورت مکانیکی یا دستی به مدت 5 دقیقه تکان دهید .
خرده شیشه هایی را که از mesh 425 عبور می نماید و روی mesh 250 باقی می ماند جمع آوری نمایید .

به کمک یک آهن ربا هر گونه خرده فلز را روی شیشه ها ار از روی شیشه ها جمع آوری نمایید.
در حدود 22 گرم از پودر شیشه و استون بصورت سوسپانسیون در آید.
مابع روی آن را خالی کنید.
این عمل را پنج بار تکرار کنید.
پودر شیشه را به یک شیشه ساعت منتقل نمایید.
اجازه دهید تا استون آن تبخیر شود.
آن را برای مدت 20 دقیقه در فور در حرارت 110 درجه سانتی گراد قرار دهید.
اجازه دهید تا خنک شود.
در حدود 20 گرم از این پودر شیشه را که آماده کرده ایم در یک

فلاسک 250 میلی لیتر وارد کنید.
در حدود 100 میلی لیتر از آب مقطر فاقد کربن دی اکسید به آن بیافزائید
آن را وزن کرده و وزن را یادداشت کنید.
به عنوان شاهد 100 میلی لیتر آب مقطر فاقد کربن دی اکسید در یک فلاسک 250 میلی لیتر وارد کنید.
فلاسک را وزن کرده و وزن آن را یادداشت کنید.
فلاسک ها را با استفاده از فویل آلمینیومی که با آب مقطر فاقد کربن دی اکسید آبکشی نموه اید ببندید.
مطمئن شوید که پودر شیشه بصورت کاملاً یکنواخت در ته فلاسک پراکنده شده است.
فلاسک ها را درون اتوکلاو قرار دهید و دما را در 21 درجه سانتی گراد برای مدت 30 دقیقه نگهدارید.
تا دمای 100 درجه سانتی گراد حرارت دهید و اجازه دهید تا برای مدت 10 دقیقه بخارات درون اتوکلاو خارج گردد.
درجه حرارت را تا دمای 121 درجه سانتی گراد در مدت 20 دقیقه بالا ببرید.
درجه حرارت را در دمای 121 درجه برای مدت 30 دقیقه نگهدارید.
درجه حرارت را از 121 درجه به 100 درجه کاهش دهید در مدت 40 دقیقه منفذ را باز کنید تا خلاء ایجاد نشود.

بعد از خنک شدن در پوشها را بردارید فلاسک ها را خشک کنید.
با استفاده از آب مقطر فاقد کربن دی اکسید فلاسک را دوباره به وزن اولیه برسانید.
میزان 50 میلی متر (این مقدار بستگی به 80 گرم خرد شده دارد) از مایع شفاف را به یک ارلن منتقل نمایید.
بلانک را در یک فلاسک مشابه با استفاده از 50 میلی لیتر آب تهیه نمایید.
به هر یک از فلاسک ها مقدار 1/0 میلی لیتر از محلول متیل را بیافز

ایید و با استفاده از سدیم هیدوکسید 01/0 مولار تیتر کنید.
نقطه پایانی واکنش را با استفاده از بلانک بدست آوید.
مقدار جواب بلانک را از جواب تست کم کنید و نتایج را به میلی بیتر 01/0 مولار به ازاء 10 گرم از شیشه گزارش کنید.
شیشه نوع 1 بیشتر از 2 میلی لیتر HC1 نیاز ندارد.
شیشه نوع 2 و 3 بیشتر از 17 میلی لیتر HC1 نیاز ندارد.
شیشه نوع 4 بیشتر از 30 میلی لیتر HC1 01/0 نیاز ندارد.
مصرفی برای بلانک HC1 میلی لیتر 2/0= مقدار
مصرفی برای شیشه HC1 میلی لیتر2= مقدار
8/1=2/0-2I شیشه از نوع تیپ
آشنایی و کنترل در پوش های لاستیکی مخصوص ظروف نگهداری محلول آبی
در پوشهایی لاستیکی از موادی تشکیل شده اند که خود نتیجه و لکانیزاسیون ترکیبات درشت ملکول (الاستومرها) هستند. الاستومرها از پلیمریزاسیون ترکیبات طبیعی بدست می آیند و با توجه به موارد کاربرد از نظر افزودنی های بکار برده شده نظیر: رنگدانه، پایدار کننده و ترکیبات ایجاد کننده پیوند های عرضی در الاستومرها، متفاوت هستند. در پوش های لاستیکی را می توان به دو دسته تقسیم کرد: نوع I که به دلیل کاربرد خاصشان باید علاوه بر دارا بودن تمام قابلیت ها، از مقاومت مکانیکی قابل توجهی برخوردار باشند. نوع II که نیازی به مقاومت مکانیکی بالایی ندارند.

در پوشی که برای ظروف حاوی محلول ها به کار می رود باید از ترکیبات غیر قابل نفوذ باشد در مجاورت با مواد پایداری خود را از دست نداده و باعث ایجاد سمیت در محلول نشود.
ترکیب در پوش ها در طول زمان نباید تغییر کند و در صورت وجود تردید در این مورد باید تست مطابقت با استاندارد ها را بطور کلی یا فقط جزئی از آن انجام دهید.
در پوش ها را قبل از مصرف شستشو و استریل کنید.
در پوش های لاستیک خاصیت الاستیک داشته شفاف یا مات هستند و زنگ آن ها به مواد افزو

دنی اضافه شده بستگی دارد این در پوش ها عاری از هر گونه فیبر و ذرات خارجی لاستیک های بازیافتی هستند.
تهیه محلول استاندارد آمونیوم PPM 2.5
روش کار:
1- دقیقاً 0741/0 گرم از پودر آمونیوم کلراید را وزن کنید.
2- این مقدار را در آب حل کرده و در بالن ژوژه 100 میلی لیتر به حجم برسانید.
3- این محلول استاندارد همیشه باید تازه تهیه شود.
تهیه محلول استاندارد آمونیوم ppm 7/0
روش کار:
1- دقیقاً 1 میلی لیتر از محلول استاندارد 5/2 پی پی ام آمونیوم را با 5/2 میلی لیتر آب رقیق کنید.
تهیه محلول پتاسیم تتراید و مرکورات قلیایی:
روش کار:
1- مقدار 1 گرم پودر پتاسیم یدید را دقیقاً وزن کنید.
2- مقدار 15 گرم از پودر یدید جیوه II را وزن کنید.
3- مخلوط دو ماده بالا را در آب حل کرده و به حجم 100 میلی لیتر برسانید.
4- قبل از مصرف این محلول آن را به حجم مساوی از محلول سدیم هیدوکسید 25% وزنی به حجمی مخلوط کنید.
تهیه محلول A برای تست های کنترل در پوش
روش کار:
1- مقداری از در پوش ها را در ظرف شیشه ای قرار دهید بطوریکه همه در یک سطح قرار گیرند. (مساحت کل درپوش ها در کنار هم بیش از 100 سانتی متر مربع نباشد)
2- بقدری روی آن آب بریزید که درپوش ها در زیر آب قرار بگیرند.
3- ظرف را به مدت 5 دقیقه بجوشانید.
4- 5 مرتبه با آب سرد آب بکشید.
5- در پوش های شسته شده را در فلاسک دهانه گشاد از نوع I قرار داده و 200 میلی لیتر آب به آن اضافه کنید.

6- فلاسک را وزن کنید و دهانه فلاسک را با فویل آلمینیوم بپوشانید.
7- دمای اتوکلاو را طوری تنظیم کنید که در مدت 30 دقیقه به دمای 123- 119 برسد و همین دما مدت 30 دقیقه بماند.
8- در مدت 30 دقیقه دما را به دمای اتاق برسانید.
9- مجدداً به آن آب اضافه کنید تا به وزن اولیه برسد.
10- فلاسک را تکان دهید و فوراً محلول را سرریز کرده و از درپوش های جدا کنید(محلول A)
11- محلول A را در تمام تست ها هنگام استفاده کاملاً تکان دهید.
اندازه گیری میزان آلومینیوم موجود در درپوش
مواد و وسایل:
مواد
محلول A
محلول 2 مولار سدیم هیدروکسید
آب مقطر
پتاسیم تتراید و مرکورات قلیایی
استاندارد آمونیوم (1 PPM NH4)
2- وسایل:
3- روش کار:
1- در صورت لزوم برای قلیایی کردن محلول A، 5 میلی لیتر از آن را با استفاده از محلول 2 مولار سدیم هیدروکسید قلیایی کرده و سپس با آب مقطر تا حجم 15 میلی لیتر رقیق کنید.
2- به محلول حاصل 3/0 میلی لیتر پتاسیم ید و مرکورات قلیایی که با 15 میلی لیتر آب رقیق شده اضافه کنید.
3- محلول دیگری هم با همین روش با استفاده از 10 میلی لیتر محلول استاندارد آمونیوم (1 PPM NH4) تهیه کنید.
4- دقت کنید که اگر محلول A برای قلیایی کردن از سدیم هیدروکسید استفاده کردید برای محلول استاندارد هم همین را اضافه کنید.
رنگ زرد دو محلول باید یکسان باشد.
چند قطره فنل فتالئین به آن اضافه کنید.
محلول فوق را با سدیم هیدروکسید تهیه شده تا ایجاد رنگ صورتی پایدار تیتر کنید.
هر 2/204 میلی گرم پتاسیم دی فتالات معادل 1 میلی لیتر از سدیم هیدروکسید 1 نرمال است.
محلول سدیم هیدروکسید 01/0 نرمال را با استفاده از هیدروکسید سدیم تهیه شده آماده کنید.
هیدروکسیدهای قلیایی در مجاورت هوا کربن دی اکسید جذب می کنند.

این محلول را باید در ظورف کاملاً در بسته نگهداری شده و در هنگام مصرف استاندارد شوند.
نتیجه این تست برای نمونه: آمونیوم خیلی کم بود در حدود PPM 1. چون شفاف می ماند و رنگش تبدیل به آجری نمی شود.
اندازه گیری شفافیت و رنگ محصول:
مواد:
1-1: محلول A
2-1: محلول بلانک
روش کار:
3-1: محلول A بدست آمده از درپوش را با محلول بلانک مقایسه کنید.

فصل چهارم
روشهای تعیین مقدار پروتئین در نمونه ها
روش کجدال
Reference protein/BSA
رنج مفید/ 2-2%
Preinciple involved / تشکیل کمپلکس رنگی
طول موج /540
روشها / روش بیوره
مزایای این روش : این روش آسان و سریع است.
معایب : تداخل مواد دیگر در انجام این تست – نیاز به نمونه نیاز دارد.
2-
BSA 2%-02% تشکیل کمپلکس رنگی 750 روش لوری
مزایا: روش حساس است.
معایب : انجام آن مشکل است و اتیاج به timing go دقیقی دارد.
3-
Enolase 2-0 اسید آمینه های تیروزین و تریتیپوفان را دتکت می کند 280/260 warbury cheristan روش
مزایا : این روش سریع است – بدون ترتیب نمونه انجام می شود بنابراین می توان نمونه را بازیابی کرد.

معایب : زیاد حساس نیست – یک سی سی نمونه احتیاج است.
4-
BSA 02% - 0 پیوند زرد رنگ با پروتئین 595 Bradford روش
مزایا : سریع – حساس – راحت – دخالت کم مواد موجود در محیط .
معایب : گران – دقت زیادی نیاز دارد .
در قسمت بالا روشهای مختلفی که برای اندازه گیری پروتئین وجود دارد با یکدیگر مقایسه شده اند . همه آنها معایب و مزایایی را دارند و انتخاب بهترین رو

ش بستگی به عواملی دارد از جمله : مقدار نمونه اینکه در دسترس می باشد زمانی که برای انجام آزمایش در اختیار داریم و نوع دستگاه اسپکتروفتومتریکه در اختیار داریم . بعنوان مثال روش سوم روش بسیار سریعی است که مقدار پروتئین نمونه را به طور تقریب به ما می گوید. در صورتی که روش lowry یا Brad ford حساس و دقیق هستند. با استفاده از روش سوم می توان مقدار تقریبی پروتئین نمونه را بدست آورد و با استفاده از این اطلاعات نمونه را به نحوی رقیق کرد که در محدوده حساسیت آزمایش بعدی قرار گیرد.
تهیه محلول مینرالیزاتور جهت اندازه گیری ازت پروتئین (کجلدال)
تهیه محلول مینرالیزاتور:
مقدار g150 پتاسیم سولفات K2SO4 را در بشر ریخته و کاملا حل می کنیم (کمی حرارت) سپس g6، H2O7، CuSO4 یا g62/2، H2O5، CuSO4 را در بشر ریخته کاملا حل می کنیم سپس cc150 اسید سولفوریک غلیظ را به آن کم کم اضافه می کنیم و در نهایت حجم محلول را توسط آب مقطر دو بار تقطیر به حجم cc900 می رسانیم .
تهیه سود 10 نرمال جهت اندازه گیری ازت پروتئین و توتال پروتئین (کجلدال)
تهیه سود 15 نرمال :
جهت تهیه یک لیتر سود 15 نرمال مقدار 400 گرم سود را در یک بشر یک لیتری ریخته و زیر هود قرار می دهیم و در مقداری آب مقطر دوبار تقطیر حل می کنیم سپس محتویات بشر را به یک بالن ژوژه یک لیتری منتقل کرده و صبر می کنیم تا کاملا سرد شود و سپس به حجم یک لیتر می رسانیم .
تهیه اسید بوریک 2% جهت تعیین ازت پروتئین و پروتئین توتال
تهیه اسید بوریک 02% :

جهت تهیه اسید بوریک 2% مقدار 2 گرم اسید بوریک را وزن کرده و در یک بشر ریخته و دقیقا توسط بالن ژوژه 100 میلی لیتری به میزان 100 میلی لیتر آب مقطر دوبار تقطیر را به 2 گرم اسید بوریک اضافه کرده و اسید بوریک را کاملا حل می کنیم .
تهیه معرف جهت تعیین ازت پروتئین و توتال پروتئین
تهیه معرف :
این معرف مخلوطی از برموکرزول گرین و متیل رد می باشد. بدین ترتیب که :
1% گرم برموکروزول گرین را توسط الکل 95 در یک بشر حل می کنیم و سپس در بالن ژوژه 1000 میلی لیتر به حجم می رسانیم .

معرف دوم متیل رد می باشد 1% گرم متیل را وزن کرده و توسط مقداری الکل اتیلیک 95 حل کرده و به بالن ژوژه 100 میلی لیتری منتقل می کنیم و توسط الکل به حجم می رسانیم .
معرف کجلدال شامل 10 میلی لیتر معرف برموکروزول گرین بعلاوه 2 میلی لیتر معرف متیل رد می باشد که می توانیم 100 میلی لیتر برموکروزول گرین را به 20 میلی لیتر معرف متیل رد اضافه کنیم که در نهایت 120 میلی لیتر معرف کجلدال داریم.
تهیه H2SO4 70/N جهت اندازه گیری ازت پروتئین و پروتئین توتال
تهیه H2SO4 70/N
با توجه به نرمالیته خواسته شده یعنی 014%=70/N اگر رقت را سه بار تکرار کنیم نرمالیته دقیق تر خواهد بود بدین ترتیب که :
مقدار 3/27 میلی لیتر از اسید سولفوریک غلیظ مرک برداشته به حجم 100 میلی لیتر توسط بالن ژوژه می رسانیم بدین ترتیب اسید 10 نرمال خواهیم داشت سپس از این اسید 10 نرمال 10 سی سی برداشته به حجم 100 سی سی می رسانیم پس اسید 1 نرمال خواهیم داشت و از این اسید یک نرمال 14 سی سی بر میداریم به حجم یک لیتر می رسانیم در نتیجه اسید 014% نرمال خواهیم داشت یا 70/N.

تعیین ازت پروتئین و پروتن توتال نمونه های توبوکولین گاوی به روش کجلدال
مواد وسایل :
1-1- پتاسیم سولفات K2SO4
1-2- سولفات مس 5H2O . CUSO4
1-3- سولفوریک غلیظ H2SO4
1-4- سدیم هیدروکسید NaOH
1-5- برموکروزول گرین

1-6- متیل رد
1-7- الکل اتیلیک
1-8- اسید بوریک
1-9- آب مقطر دوبار تقطیر
1-10- فیول
تعیین ازت پروتئین و پروتئین توتال نمونه های توبر کولین گاوی به روش کجلدال :
3- روش کار :
جهت راه اندازی و کار با دستگاه کجلدال به ترتیب زیر عمل می کنیم :
1- بالن محتوی سنگ جوش را تا نصف آب یک بار می ریزیم سپس درب آن را می بندیم .
2- آب کنداسور را باز می کنیم .
3- حرارت زیر بالن را روشن می کنیم و درمینول دستگاه مقداری آب می ریزیم .
4- بعد از اینکه حرارت را زیر بالن قرار دادیم توسط گیره زیر قیف دستگاه را می بندیم.
5- اجازه می دهیم کمی دستگاه توسط آب مقطر کار کند تا دستگاه کاملا شستشو داده شود.
حدود چند میلی لیتر آب از کنداسور وارد بشر شود شستشوی دستگاه کافی است.
نمونه توبرکولین گاوی را جهت آماده سازی برای دستگاه کجلدال مراحل زیر را روی آن انجام می دهیم .
مرتبا 1سی سی از نمونه توبرکولین گاوی برداشته و در فیول می ریزیم برای دقت در کار از هر نمونه 2 تست می گذرانیم یعنی در دو فیول هر کدام 1 سی سی از نمونه می ریزیم و 6 سی سی محلول میزالیزاتور به آن اضافه می کنیم و روی هیتر می گذاریم تا پروتئین آن هضم شود.
هضم بایستی حدود 24 ساعت طول بکشد اول زنگ محلول تیره می شود سپس کم کم سیاه شده و به حالت جامد در می آید و در 3-2 ساعت مانده به 24 ساعت نمونه جامد و قهوه ای تیره شده حرارت را افزایش داده و به مدت 2ساعت حرارت بالا را ادامه می دهیم تا نمونه بصورت سبز شفاف با غلظت زیاد در آید و بعد از سرد شدن به صورت رنگ آبی در می آید و اگر نمونه رقیق

باشد سبز آبی مایع می باشد و اگر نمونه با پروتئین بالا باشد نمونه آبی جامد در می آید.
دستگاه کجلدال را که روشن کرده بودیم و توسط آب مقطر شستشو داده بودیم حال آماده کار می باشد بدین ترتیب که نمونه موجود در مینول را کمی آب مقطر به آن اضافه کرده و کمی حرارته وارد دستگاه می کنیم . سپس توسط آب مقطر مینول را شستشو داده مجددا وارد دستگاه می کنیم آنگاه 8 میلی لیتر سود 10 نرمال از قیف به دستگاه وارد می کنیم مجددا قیف را با آب مقطر می شوییم . در یک بشر 100 میلی لیتری که خط نشان 80میلی لیتر داشته باشد 10 میلی لیتر اسید بوریک 2% و 3-5 قطره معرف می ریزیم رنگ محتویات بشر صورتی می شود. حال بشر ر

ا زیر کنداسور دستگاه کجلدال قرار می دهیم . حرارت را زیر بالن می گذاریم بعد از قرار دادن حرارت زیر قیف دستگاه را می بندیم سپس دستگاه شروع به کار می کند و از کنداسور آمونیاک وارد

بشر می شود و رنگ محتویات بشر از صورتی به آبی تغییر رنگ می دهد.
تا خط نشان 80 میلی لیتر بشر را پر می کنیم سپس حرارت را قطع کرده و بشر را با H2SO4 70/N تیتر می کنیم و مقدار اسید تیتر شده را یادداشت می کنیم .
محاسبه نمونه های توبرکولن :

ازت پروتئین A=0.2
=6.25*A پروتئین توتال
31/5 AN- BXسری
نتیجه پروتئین توتال در نمونه مرحله 3
Bovin tuber culin
حجم اسید مصرفی cc 65/1 =
ازت پروتئین توتال
واکنش های انجام شده در روش کجلدال :
نقش H2SO4 میزالیزاتور و حرارت و طی واکنش زیر مشخص می شود .
H2SO4 حرارت H2O+O+SO2
اکسیژن به دست آمده ماده آلی سرم را می سوزاند و ازت ماده آلی باقی می ماند مقدار H2SO4 زیاد است . لذا
اضافی + H2SO4ازت باقی مانده پروتئین SO4(NH4)2

2H2O+Na2SO4+2NH3 2NaOH+ SO4(NH4)2
این همان NH3 متصاعد شده است که در مبرد سرد شده و مایع می شود سود را باید زیاد بزنیم چرا که محیطی که سود زیاد باشد آمونیاک قرار می کند و متصاعد میشود CuSO4 نقش کاتالیزور دارد.
اسید بوریک موجود در بشر یک اسید ضعیف است و NH3 مایع شده را سریع جذب می کند.
لازم به ذکر است که در محاسبات علت کم کردن 2% از می

زان اسید مصرفی بخاطر ازت آمونیاکی است در میزالیزاتور وجود دارد. در ضمن علت ضرب کردن در عدد 25/6 به پروتئین هایی که بافت گوشتی دارند بر می گردد پس تنها پروتئین هایی مثل سرم ضد عقرب گزیدگی و یا... در این عدد ضرب می شود.
نکته : در اندازه گیری سرم ازت توتال به روش کجلدال تنها ازت هایی که ریشه آمونیاکی داشته باشد از این طریق قابل محاسبه اند.
در روش کجلدال آماده سازی نمونه برای موادی مثل توکسوئید ،آنتی ژن ، سرم یا پلاسما متفاوت می باشد بنابراین روش کار برای تهیه نمونه و محاسبات این مورد را توضیح می دهیم.
تهیه 1100% TCA جهت تعیین ازت پروتئین و پروتئین توتال کجلدال
تهیه TCA100%
تری کلرواستیک اسید : مقدار 100 گرم را وزن کرده و 100 سی سی آب مقطر به آن اضافه می کنیم تا یک محلول TCA100% داشته باشیم :
تهیه سرم فیزیولوژی جهت تعیین ازت پروتئین و پروتئین توتال کجلدال
تهیه سرم فیزولوژی :

منظور از سرم فیزولوژی که همان سالین می باشد یعنی محلول 5/8 گرم سدیم کلرید در 1000 سی سی آب مقطر.
مقدار 85% گرم را در 100 گرم سی سی آب مقطر حل می کنیم.
آماده سازی نمونه های توکسوئید جهت تعیین ازت پروتئین و پروتئین توتال
نمونه توکسوئید :

20 سی سی از نمونه را برداشته و 2/2 سی سی TCA100% به آن اضافه می کنیم . در سانتریفور قرار می دهیم سپس محتویات تست تیوب را با 1 قطره سود 10 نرمال حل کرده و محتویات تست تیوب را به مینول منتقل می کنیم چند بار تست تیوب را می شویم و سپس 6 سی سی منیرالیزاتور به فیول اضافه می کنیم مینول را برای حرارت روی هیتر می گذاریم تا پروتئین هضم شود بقیه مراحل کار در دستور کار کجلدال توضیح داده شده است .
آماده سازی نمونه آنتی ژن جهت تعیین ازت پروتئین و پروتئین توتال

نمونه ارسالی آنتی ژن را 01% رقیق می کنیم ( مراحل زیر جهت یک نمونه است برای گذاشتن دو تست از هر نمونه باید 01% رقیق شده و تا 20 سی سی برداریم )
یعنی 1 سی سی از نمونه بر می داریم و به حجم 100 سی سی می رسانیم 20 سی سی از 100 سی سی را بر می داریم و در لوله سانتریفوژ می ریزیم و 2/2 TCA100% ب

ه آن اضافه می کنیم . بعد در سانتریفوژ قرار می دهیم محلول رویی را خالی می کنیم رسوب آن را با یک قطره سود 10 نرمال شماره 2 حل می کنیم و بعد محلول را به فیول ها منتقل می کنیم با آب مقطر تست تیوب را می شوییم و به فیول منتقل می کنیم سپس 6 سی سی منیرالیزاتور شماره 1 را به فیول اضافه می کنیم فیول را روی هیتر می گذاریم تا پروتئین آن هضم شود.
آماده سازی نمونه سرم یا پلاسما جهت تعیین ازت پروتئین و پروتئین توتال
روش آماده سازی نمونه های سرم یا پلاسما برای دستگاه کجلدال :

1 سی سی از نمونه سرم یا پلاسما را بر می داریم و 9 سی سی آب مقطر به آن اضافه می کنیم بعد از این 10 سی سی نمونه 1 سی سی بر میداریم و به آن 19 سی سی سرم فیزیولوژی اضافه می کنیم سپس 2/2 سی سی TCA100% به آن اضافه می کنیم .
نمونه را سانتریفوژ می کنیم (دور 1500 به مدت یک ربع)
رسوی حاصل را با یک قطره سود 10 نرمال شماره 2 حل می کنیم و رسوب حل شده را وارد فیول می کنیم سپس چند بار با آب مقطر می شوییم تا کاملا محتویات تست تیوب وارد فیول شود سپس 6 سی سی منیرالیزاتور شماره 1 به محتویات فیول اضافه می کنیم حجم کل شستشوی تیوب و منیزالیزاتور نباید از نصف حجم فیول بیشتر باشد. فیول ها را روی اجاق قرار می دهیم تا هضم شود.
فصل دوم
تهیه واکسن
تست فرمالین
تست یون آلومینیوم AL-3
تست تیومرسال
تهیه واکسن

برای تولید واکسن نیاز به یک محیط کشت داریم که کاملا استریل شده باشد و بعد از استریل کردن به فرمانتور منتقل می شود.
محیط کشت شامل موادی می باشد که برای تغذیه و رشد باکتری مورد نیاز است مثلا در تولید واکسن سیاه سرفه موارد نظیر :

Casamino acid – KCI- KH2PO4- Mgcl2- 6H2O- Nicotinic acid- Glutathon- Stearch- Distilled Water- NaOH5 N to PH6/8-6/9
و یا در تولید واکسن کزاز محیط کشتی شامل :
NZ – CaSe – Glucose – NaCL – Na2HPO4 – KHPO4
MgSO4 – 7H2O
FeSO4 – 7H2O – L – Cystine – L – tyrosine – Uracil – Ca – Pantothinate – Thiamine – Riboflavin – Pyridoxin – Biothin – Distilled Water – NaOH 10 N to PH 7/2-7/3
آنچه که در محیط کشت اهمیت زیادی دارد مقدار مواد دمای محیط و ph محیط و فشار است.
بعد از اینکه محیط کشت استریل و در فرمانتور قرار گرفت بذر اولیه که باکتری لئوفیلیز شده می باشد به محیط کشت اضافه می شود. بعد از گذشت زمان معینی که برای هر باکتری متفاوت

است برداشت صورت می گیرد و محصول که توکسین می باشد را به گرم خانه برده در دمای 37 الی 40 درجه نگه می دارند در این مرحله از ماده ای مانند فرمالین در مورد توکسین دیفتری یا کزاز استفاده می شود که باعث میشود توکسین به توکسوئید تبدیل شود بعد از گذشت زمانی در حدود 40 روز مثلا برای تهیه واکسن کزاز تصفیه صورت می گیرد که معمولا از صافی های غشایی استفاده می شود در اینجا لازم است بدانیم واکسن سیاه سرفه که در شرایط میکروبی خاص قرار داشته و در فاز ناخوش زایی می باشد در محیط کشت مصنوعی رشد نموده و سپس در اثر کهنه شدن در حضور ماده ضد عفونی به نام مرتیولات مرده و مقدار زیادی پادگن محلول از سطح پیکر آنه

ا جدا می شود و واکسن ضد سیاه سرفه را تشکیل می دهد. دراین مرحله بعد از کنترل روی حیوانات نظیر خوکچه هندی بعد از تغلیظ بوسیله کروماتوگرافی ستونی ژل سفاوکس به قسمت فرمولاسیون یا mixing می رسیم در این مرحله که پس از مطمئن شدن از اینکه توکسین کاملا به توکسئوئید تبدیل شده PH تنظیم شده فرمالین و مرتیولات در رنج دلخواه است. برگشت ناپذیری را در 6 هفته مهلت می دهیم ایمنی بودن را کنترل می کنیم . در فرمولاسیون برای تهیه هر واکسن موادی متفاوت است در واقع کارهای نهایی صورت می گیرد تا مثلا یاور دلخواه به واکسن منتقل شود. درمورد واکسن سه گانه دیفتری ، کزاز ، سیاه سرفه مواردی نظیر :
ALCI3 – NaOHN/2 – Na2HPO4 – 2H2O – KH2PO4
Sodium acetate.3H2O – Sodium acedium acetate anhydrouse

NaCL – HCL / NaOH to PH 6/8
تست فرمالین
تست فرمالین یکی از آزمایشات مربوط به واکسن ها در بخش فیزیکوشیمی می باشد دراین آزمایش مقدار فرمالین موجود در واکسن تولید شده را بدست می آورند فرمالین ماده ای است سمی که جهت inactive کردن توکسین و تبدیل آن به توکسوئید واکسن اضافه می شو

د.
این ماده باعث می شد خاصیت ایموژنوسیتی تقویت شود و خاصیت پاتوژنوسیتی از بین رود.
چون این ماده سمی می باشد تست اندازه گیری مقدار آن در واکسن ضروری می باشد.
روش کار :
1- به یک میلی لیتر از نمونه رقیق شده مقدار 4 میلی لیتر آب و 5 میلی لیتر معرف استیل استون R1 اضافه کنید.