بخشی از مقاله
چکیده
آزولا یک سرخس آبزي است که به علت همزیستی خود با جلبک Azolla-Anabaena و تثبیت نیتروژن مورد توجه است. محققین ایرانی با سفر به کشورهاي فیلیپین و هندوستان، با این گیاه آشنا شدند و در نهایت، در سال 1363جلبک غیر بومی آزولا از کشور فیلیپین وارد ایران شد و با اهداف تولید علوفه براي دام و طیور و تهیه کود سبز براي مزارع برنج استان گیلان در منطقه رهاسازي گردید و از آنجا به تالاب انزلی راه یافت. تاریخ طبقه بندي Azolla - Azollaceae - طولانی و پیچیده است.
مطالعات قبلی از دادههاي سیتولوژیک، مورفولوژیکی و مولکولی براي طبقه بندي آزولا استفاده کرده اند، در این مطالعه جهت درك رابطهي فیلوژنتیکی نمونه آزولا جمع آوري شده از تالاب انزلی از توالی غیر کد کنندهي ITS براي تعیین گونهي آزولا جمع آوري شده از تالاب انزلی استفاده شد.
جهت تکثیر ناحیهي ITS در سه گونه A. filiculoides، A. pinnata و آزولا جمع آوري شده از تالاب انزلی از واکنش PCR با جفت آغازگرهاي ITS4 و ITS5 استفاده گردید. درخت فیلوژنتیکی ترسیم شده مشخص کرد که آزولا جمع آوري شده از تالاب انزلی از گونهي A. filiculoides نشات گرفته است. تجزیه و تحلیل رده بندي این دادهها تقسیم آزولا به دو بخش Azolla و Rhizosperma را تایید کرد.
مقدمه
Azolla یک سرخس آبی کوچک شناور، بومی آسیا، آفریقا، آمریکا و اروپا است. این گیاه در باتلاقها، جويها و حتی در دریاچه و رودهایی که آب متلاطم نیست زندگی می کند. لامارك جنس Azolla را در سال 1783 پس از بررسی نمونههایی که از شیلی آورده بود بنیان گذاري کرد. اخیرا تاکسونومیستها آزولا را در خانوادهي به نام Azollaceae قرار داده.
طبقه بندي خانواده Azollaceae بسیار بحث برانگیز است و چندین طبقه بندي در طول سالها پیشنهاد شده است. طبقه بندي بر اساس ویژگیهاي رویشی به علت تغییر پذیري بالاي این ویژگیها، میتواند باعث اشتباه در طبقه بندي شود. طبقه بندي بر اساس ویژگیهاي تولید مثلی قابل اعتمادتر است اما القاي تولید مگاسپورکارپ و میکروسپورکارپ در آزولا بسیار مشکل است.
جنس Azolla بر اساس صفات مرفولوژیک و تولید مثلی به دو زیر جنس Azolla و Rhizosperma و شش گونه بر اساس اندامهاي تولید مثلی مگاسپور و 1 Glochidiaتقسیم بندي میشود. حضور و یا محل Glochidia در 2 Massulae میتواند یک ویژگی مشخص باشد
گونههاي A. filiculoides، A. caroliniana, A. microphylla و A. mexicana متعلق به بخش Azolla هستند و موقعیت Glochidia آنها، در سطح Massulae است در حالی که بخش Rhizosperma شامل گونه- ي A. pinnata میباشدکه Glochidia آن در داخل Massulae قرار دارد ولی A. nilotica فاقد Glochidia است . - 5 - مطالعات موهاي خارداري که در سطح Massulae قرار دارد و منجر به تسهیل باروري میشود.
2 در سرخس آبی خانوادهي Azollaceae، Massulae از گسترش یک لایهي موسیلاژي غنی از مواد غذایی در اطراف اسپور مادر تشکیل شده است، در میکروسپورانژیوم تعداد متنوعی از Massulae توسعه مییابد.
امروزه از نشانگرهاي مولکولی به طور گسترده به منظور طبقه بندي و بررسی تکسونومیکی موجودات مختلف استفاده میشود. ژن RNA ریبوزومی3یوکاریوتی به صورت تکرارهاي پشت سر هم در هسته قرار دارد و رونوشت اولیه آنها شامل زیر واحد بزرگ - 28S - rRNA، 5.8S و زیر واحد کوچک - 18S - rRNA است که توسط ناحیهي رونویسی داخلی4 از یکدیگر جدا میشوند. از آنجا که این توالیها نرخ تکاملی بالایی دارند و در همه ژنهاي rRNA یوکاریوتی وجود دارند، در نتیجه براي آنالیز فیلوژنتیکی در میان گونههاي مرتبط و یا در بین جمعیت هاي درون یک گونه به کار میرود. ناحیه ITS2 منبع اصلی تنوع توالی ITS میباشد و داراي توالی کوتاهتر و سادهتري نسبت به ITS1 است به همین دلیل به عنوان یک نشانگر فیلوژنتیک مناسب است.
اخیرا آغازگرهاي داخلی طراحی کرده اند که بخشهاي هم پوشان نواحی از دو زیر واحد ITS1 و ITS2 را تکثیر میکنند. ترکیبی از این آغازگرهاي داخلی با آغازگر خارجی در یک PCR منجر به تکثیر تمام ناحیه ي ITS میشود. امروزه از دادههاي توالی DNA براي شفاف سازي رابطهي فیلوژنی گونههاي آزولا استفاده شده است. در این تحقیق از توالی غیر کد کننده ITS براي شناسایی نمونهي آزولاي جمع آوري شده از تالاب انزلی استفاده شد چرا که این توالی داراي بیشترین پتانسیل براي نمایش تنوع بین گونهها هستند
مواد و روشها
گیاهان آزولا از سه گونهي A. filiculoides ، A. pinnata و Azolla spp جمع آوري شده سپس از قسمت ساقه برگی آنها استخراج DNA انجام گرفت. با هدف تکثیر ناحیهي ITS1 ،5/8S و ITS2 در گونههاي A. filiculoides و A. pinnata و آزولا جمع آوري شده از تالاب انزلی از واکنش PCR با جفت آغازگرهاي ITS4 و ITS5 استفاده شد. پس از انجام واکنش PCR و تکثیر ناحیه مربوطه براي هر سه گونهي آزولا خالص سازي ناحیهي مورد نظر از ژل انجام شد؛ پس از خالص سازي قطعات از ژل در پلاسمید pTG19-T همسانه سازي شد و پس از استخراج پلاسمید نوترکیب به شرکت Bioneer جهت توالی یابی ارسال گردید. توالیهاي توالییابی جهت تایید صحت ردیابی و جستجو شباهت توالیها در بانک داده NCBI با استفاده از BLAST بررسی شدند. آنالیز فیلوژنتیکی neighbor-joining براي توالیهاي نوکلئوتیدي با استفاده از نرم افزار MEGA4 انجام شد. ارزیابی شاخههاي درخت فیلوژنتیکی با استفاده از روش Bootstrap انجام گردید.
نتایج و بحث
نتایج همردیف سازي توالیهاي ناحیهي ITS نشان داد که این ناحیه در گونه A. filiculoides داراي همولوژي 95-97 درصد با توالیهاي متناظر خود در گونه A. filiculoides موجود در پایگاه داده NCBI و گونه A. pinnata داراي همولوژي 92-100 درصد با توالیهاي متناظر خود در گونه A. pinnata موجود در پایگاه داده NCBI میباشند. همچنین ناحیهي ITS در رقم جمع آوري شده از تالاب انزلی داراي 91 درصد همولوژي با ناحیهي ITS در گونه A. filiculoides و 90 درصد همولوژي با ناحیهي ITS در گونه A.rubra موجود در پایگاه دادهي NCBI است. آنالیزهاي فیلوژنتیکی تخمینی از چگونگی اشتقاق اعضاي یک خانواده در طی تکامل هستند. به منظور بررسی رابطهي بین گونهها، ابتدا توالیهاي ناحیهي ITS مربوط به گونه هاي مختلف آزولا موجود در پایگاه داده NCBI به همراه توالیهاي ناحیهي ITS توالی یابی شده در گونههاي A. filiculoides و A. pinnata و آزولا جمع آوري شده از انزلی با استفاده از نرم افزارMEGA4 همردیف شدند - شکل - 1 و درخت فیلوژنتیکی ریشه دار با استفاده از روش Neighbor-joining که یکی از روشهاي رایج تهیه درخت فیلوژنتیکی است رسم شد قابل ذکر است که از ناحیهي ITS، Salvinia molesta به عنوان خارج گروهی استفاده شد. جهت بررسی صحت درخت ترسیم شده از آزمون Bootstrap با تکرار پذیري 100 استفاده شد. رابطهي تکاملی گونههاي آزولا در قالب درخت فیلوژنتیکی در شکل 2 نشان داده شده است.
شکل-1 همردیف سازي توالیهاي ناحیهي ITS ارقام مختلف آزولا با استفاده از نرم افزار MEGA4
شکل-2 درخت فیلوژنتیکی بر اساس روش Neighbor-joining مربوط به توالیهاي ITS گونههاي آزولا
درخت فیلوژنتیکی گونههاي آزولا را به دو گروه تقسیم نمود که گروه A شامل بخش Azolla و در برگیرندهي ارقام A. rubra، A. filiculoides، A. mexicana، A. microphylla و A. caroliniana و A. cristata می باشد و گروه B شامل بخش Rhizosperma و در برگیرندهي ارقام A. pinnata و A. nilotica است. درخت فوق به وضوح نشان میدهد که Azolla spp. جمع آوري شده از تالاب انزلی از گونه A. filiculoides نشات گرفته است. درخت فیلوژنتیکی رسم شدهي فوق با طبقه بندي ارائه شده توسط سونسون در سال 1944 که گونههاي آزولا را بر اساس ویژگی مورفولوژیکی به دو بخش Azolla و Rhizosperma تقسیم کرد مطابقت دارد
