بخشی از مقاله
چکیده
ویروس Y سیب زمینی از جنس Potyvirus و یکی از مخربترین ویروسهاي گیاهی است. به منظور ردیابی و شناسایی ویروس Y سیب زمینی و نژادهاي ویروس Y، در تابستان 1389 نمونه برداري از مزارع توتون استان گلستان به عمل آمد. نمونههاي داراي علائم موزائیک و نکروز برگها بر روي یخ براي شناسایی و مطالعات بعدي به آزمایشگاه منتقل شدند.
سپس ویروس Y سیب زمینی در نمونه ها با استفاده از روشهاي سرولوژیک - DAS-ELISA - و مولکولی - RT-PCR - تعیین گردید. در روش DAS-ELISA تعداد زیادي نمونه با درجات متفاوتی از آلودگی شناسایی شد. سپس، با استفاده از کیت RNX-PLUS توده RNA کل از برگهاي گیاهان آلوده به PVY استخراج و cDNA کل ساخته شد. آزمون PCR با استفاده از آغازگرهاي ویژه طراحی شده از ناحیه پروتئین پوششی ژنوم ویروس PVY صورت گرفت. بعد از الکتروفورز محصول PCR برروي ژل آگارز %1، باند 1000bp مورد انتظار تنها در نمونههاي آلوده تکثیر گردید.
مقدمه
ویروس Y سیب زمینی، ویروسی رشته اي و گونه تیپ جنس پوتی ویروس - Potyvirus - از خانواده پوتی وایریده می باشد که از مهمترین ویروسهاي سیب زمینی است و گسترش جهانی دارد . - 2 - این خانواده، بزرگترین گروه ویروس هاي گیاهی را شامل می شود. نشانه هاي حاصل از آلودگی توتون به PVY بسته به جدایه ویروس و ژنوتیپ توتون، شامل روشن شدن رگبرگ ها و موزائیک تا نکروز شدید برگ و لکه هاي نکروتیک در برگ ها و ساقه ها می باشد - شرو و لوکاس، . - 1991 آلودگی به PVY موجب کاهش کیفی و کمی تولید توتون می شود.
- سیورت، .1971 لاتور، . - 1983 هر ساله در ایران، ویروس واي سیب زمینی موجب کاهش 10 تا گاهی 100 درصد محصول توتون می گردد - شهرآیین و الهی نیا، PVY . - 2000 توسط چندین گونه شته از جمله Myzus persica به روش ناپایا انتقال می یابد که این موضوع کنترل بیماري هاي ناشی از آن را با مشکل روبرو ساخته است. در این راستا موفق ترین روش ها شامل استفاده از ارقام متحمل یا مقاوم به PVY بوده است - شرو و لوکاس، . - 1991 مدت نیم قرن است که روشهاي سرولوژیکی بطور گسترده و موفقیت آمیزي براي تشخیص ویروسهاي مختلف و رابطه بین آنها مورد استفاده قرار می گیرد.
اما این روشها در مورد پوتی ویروسها زیاد کارامد نیستند - جوردن و هاموند، .1991، سایکی و همکاران، . - 1985 این مشکل به دلیل اپیتوپهاي غالب ویریونهاي پوتی ویروسها است که قسمتهاي انتهایی متغیر آنها - مخصوصا در قسمت انتهاي - N در بعضی گونه ها توالی تکرار شونده دارند. اگر چه انواع آنتی بادي هاي مونوکلونال اختصاصی براي گروه هاي مختلف تولید شده اند که با بیش از %90 از پوتی ویروسها واکنش نشان می دهند، ولی این امکان در مورد همه پوتی ویروسها وجود ندارد - جوردن و هاموند، . - 1991
مواد و روش ها جمع آوري نمونه هاي آلوده به ویروس: از مزارع انتخابی توتون در استان گلستان بصورت تصادفی بالغ بر 200 نمونه مشکوك به آلودگی ویروس جمع آوري و سریعا بر روي یخ به آزمایشگاه منتقل گردید. تعیین آلودگی نمونه ها به :PVY آزمایش الایزا به روش مستقیم ساندویچ دو طرفه الایزا - DAS-ELISA - مطابق روش کلارك و آدمز به منظور تعیین نمونه هاي آلوده به ویروس انجام گردید.
استخراج آر.ان.اي کل از بافت گیاهی: با استفاده از کیت RNX-PLUS - شرکت سیناژن - توده RNA کل از برگهاي گیاه آلوده به PVY استخراج و سپس با کمک آغازگرهاي اختصاصی P1 و CAACTCCAGATGGAACAATTG - P2؛ CCA - TTCATCACAGTTGGC در واکنش نسخه برداري معکوس، cDNA مربوطه با کمک آنزیم ترانسکریپتاز معکوس ساخته شد و در آزمون RT-PCR با استفاده از آغازگرهاي اختصاصی تکثیر گردید.
نتایج
نتایج آزمون الایزا آلودگی شدید برخی نمونه ها را به PVY نشان داد. جفت آغازگر طراحی شده توانست تمام ایزوله هاي PVY شناخته را جدا سازي کند. براي تشخیص یک ویروس متعلق به یک خانواده یا یک گروه به آغازگري با دامنه اختصاصی وسیع احتیاج است. اما براي تشخیص اختصاصیتر استرین یا subtype، آغازگرها باید از نواحی اختصاصیتر ژنوم انتخاب شوند. در مورد پوتی ویروسها مشخص شده است که ژن پروتئین P1 بیشترین تنوع را نشان می دهد - گلایس و همکاران، . - 1996 بنابراین، آغازگرهاي مورد استفاده، در قسمت ژن پروتئین پوششی ویروس PVY طراحی گردیدند.
واکنش زنجیره اي پلیمراز-رونویسی معکوس : - RT-PCR - نمونه هاي تصادفی جمع آوري شده با استفاده از آغازگرهاي اختصاصی P1 و P2 ازمایش شدند. محصول واکنش RT-PCR یک قطعه به طول 1100bp بود - شکل 1 ب - . شناسایی نژادهاي PVY به روش زیستسنجی - bioassay - ممکن است تا چند ماه بطول انجامد اما با استفاده از RT-PCR، پوتی ویروسها و نژادهایشان را می توان در کمتر از 2 روز شناسایی کرد. با وجودي که RT-PCR در بسیاري موارد حساستر و دقیق تر از الایزا و یا دورگه سازي اسید نوکلئیک است اما کارایی و مقبولیت آن بستگی به بعضی عوامل دیگر مانند تهیه نمونه هاي گیاهی، خارج کردن بازدارنده هاي PCR و انتخاب صحیح آغازگر دارد.
بافت هاي گیاهی بسته به حضور عوامل بازدارنده، ضخامت دیواره سلولی، ترکیبات دیواره هاي سلولی، حضور پلی ساکاریدهایی مانند نشاسته و یا مواد اکسید کننده که می توانند کمیت و کیفیت اسیدهاي نوکلئیک استخراج شده را تحت تاثیر قرار دهند، متفاوت می باشند - سینگ، . - 1998 به همین دلیل براي استخراج اسید نوکلئیک علاوه بر نوع گیاه، بافت مورد استفاده و ویروس مورد مطالعه، روش استخراج نیز بایستی مد نظر قرار گیرد - سینگ و کورز، .1996، سینگ، . - 1998 روشی که در این مطالعه براي استخراج آر.ان.اي استفاده گردید از کارایی بالایی برخوردار بود و واکنشهاي PCR با کمترین مشکل و غلظت قابل قبول محصولات مربوطه صورت گرفت، اگر چه گیاهان و بافت هاي مختلف تفاوت هایی از این نظر نشان دادند.
