بخشی از مقاله
چکیده:
در این تحقیق همسانه سازی نواحی ndhB-rps7 از ژنوم حلقوی کلروپلاست کاهو بعنوان نواحی جناحین ناقل پلاستیدی در نظر گرفته شدند. طراحی پرایمرها با نرم افزارPrimer-BLAST صورت گرفت. پس از استخراج ژنوم کل، با PCR ، قطعه مورد نظر تکثیر یافته و در ناقل pTG19-T همسانه سازی شد. پس از تایید حضور قطعه ژنوم در ناقل پلاسمیدی، پلاسمیدهای نوترکیب حاصله جهت تعیین توالی نوکلئوتیدی به شرکت ژنفنآوران ارسال شدند و صحت توالی قطعه ndhB-rps7 با طول 1380bp با نرمافزارهای Blast تایید گردید. این وکتور اولین مرحله از تولید داروهای نوترکیب، واکسنهای خوراکی، مواد زیستی و ... در کلروپلاست گیاهان میباشد.
مقدمه:
مهندسی ژنتیک پلاستی چندین مزیت منحصر به فرد نسبت به انتقال ژن به هسته دارد که شامل بیان بالای ژنهای انتقالی، مهندسی چند ژنی در یک رویداد انتقال ژن، محصور نمودن ژن انتقالی از طریق وراثت مادری، جلوگیری از فرار ژن از طریق دانههای گرده، فقدان خاموشی ژن، فقدان اثرات پلیوتروپیک و عدم آلودگی زیست محیطی است.[1]
در سالهای اخیر ژنوم پلاستیدی گیاهان برای بیان ژنهای خارجی و کشاورزی مولکولی به طور فوقالعادهای مورد توجه تعداد زیادی از محققین قرار گرفته است. بیان بسیار بالای پروتئینهای نوترکیب، درون سیستمهای مهندسی شده کلروپلاستی، روشی موثر و ارزشمند را برای استفاده از گیاه به عنوان بیوراکتور مطرح میکند و در نتیجه هزینههای مراحل تهیه درون شیشهای را به شدت کاهش میدهد.
ایجاد صفات مهم زراعی؛ تولید مواد زیستی و پروتئینهای درمانی ارزشمند، تولید واکسنهای خوراکی، کنترل تنشهای زیستی و غیر زیستی ، مهندسی مسیرهای متابولیکی و کاربرد درعلوم پایه از طریق انتقال ژن به ژنومهای کلروپلاستی گیاهان امکانپذیر شده است. [2] در این میان گیاه کاهو هم با توجه به نوع مصرف و بیوماس بالای آن و همچنین بخاطر دارا بودن کلروپلاست فراوان در برگهای آن، دارای پتانسیل مطلوب برای تبدیل شدن به یک بیوراکتور جهت تولید پروتئینهای نوترکیب و واکسنهای خوراکی است.
برای انتقال ژنهای خارجی به ژنوم کلروپلاست، از توالیهای مشابه ژنوم کلروپلاست به عنوان نواحی جناحین در ناقل اختصاصی گیاه مورد نظر استفاده می شود. با توجه به وجود این جایگاههای دوتایی همولوگ در کلروپلاست گیاهان عالی میتوان از آنها برای ساخت ناقلهای پلاستیدی استفاده نمود. این روش بهخاطر شباهت بالای توالیهای انتخابی مجاور برای نوترکیبی همتا، یکی از دقیقترین و اختصاصیترین روشهای مهندسی ژنتیک در گیاهان محسوب میشود. [3]
میزان بیان ژنهای خارجی در کلروپلاست گیاهان مختلف متفاوت بوده و از %2 تا %47 کل پروتئین محلول را گزارش کردهاند که این نتایج بسیار خوب میباشند. چرا که اگر میزان بیان پروتئینی بیش از %1 کل پروتئین محلول باشد قابلیت تجاری شدن را دارد و از نظر اقتصادی مقرون به صرفه میباشد. برای مثال میزان بیان پروانسولین و GFP به ترتیب 2/5 و %36 کل پروتئین محلول در برگهای تازه کاهو گزارش شده است. [4]
مواد و روشها:
مطالعات بیوانفورماتیکی و طراحی آغازگرها: در ابتدا با مراجعه - DQ383816، توالی قطعه BLAST طراحی شد.
استخراج DNA ژنومی:
DNA ژنومی با استفاده از روش CTAB از برگ تازه گیاه کاهو استخراج شد.[5] سپس برای بررسی کمیت و کیفیت DNA ژنومی استخراج شده از الکتروفورز با ژل آگارز %0/8 استفاده شد.
- 1 واکنش زنجیرهای پلیمراز : - PCR - قطعه مورد نظر ndhB-rps7 با بکار گیری آغازگرهای اختصاصی طراحی شده و در دستگاه PCR تکثیر شد و با استفاده از کیت استخراج از ژل شرکت Bioneer اقدام به تخلیص قطعه DNA از ژل شد.
- 2 اتصال قطعه تخلیص شده به ناقل همسانهسازی :pTG19-T واکنش اتصال قطعه مربوطه با حامل pTG19-T شرکت Vivantis به صورت T/A کلونینگ توسط آنزیم T4 DNA لیگاز انجام شد.
- 3 تراریختگی باکتریهای E.coli سویه +5 با پلاسمیدهای نوترکیب:
برای این منظور ابتدا سلولهای مستعد باکتریایی E.coli سویه +5 به روش TSS تهیه شدند. سپس برای تراریختگی باکتریهای مستعد از روش شوک حرارتی استفاده شد. پس از تراریختگی باکتریهای مستعد با محلول واکنش اتصال، به سبب حضور ژن مقاومت به آنتیبیوتیک آمپیسیلین در پلاسمیدها، باکتریهایی که پلاسمیدی دریافت نکردهاند در محیط کشت انتخابی حاوی آنتیبیوتیک آمپیسیلین قادر به رشد نخواهند بود.
به منظور تشخیص باکتریهای دریافت کننده پلاسمیدهای با قطعه درجی از باکتریهای دریافت کننده پلاسمیدهای بدون قطعه درجی از تست آبی سفید استفاده شد. در این تست در صورتی که کلنی باکتریایی سفید باشد درج قطعه مورد نظر در حامل صورت گرفته است و در صورت آبی بودن رنگ کلنی، حامل فاقد قطعه است. سپس برای تایید حضور قطعه همسانه سازی شده در باکتریهای کلنی سفید، کلنی PCR انجام شد.
- 4 استخراج پلاسمید و هضم آنزیمی پلاسمیدهای حاوی قطعه :ndhB-rps7 برای این منظور پلاسمیدهای کلنی مورد نظر در محیط کشت LB/ampicillin تلقیح شدند و بوسیله کیت استخراج پلاسمید شرکت Bioneer برای ارسال به توالییابی استخراج شدند. تایید حضور قطعه در پلاسمیدهای استخراج شده از کلنیهای سفید، با برش پلاسمیدها با آنزیم EcoR مشخص شد.
نتایج و بحث:
پس از انجام PCR بر روی DNA استخراج شده از کاهو قطعهndhB-rps7 با طول 1380 bp در این گیاه بر روی ژل مشاهده شد که این خود حاکی از مناسب بودن پرایمرهای طراحی شده در تکثیر این قطعه میباشد. - شکل - 1
