بخشی از مقاله
چکیده -
سرطان معده ازجمله سرطانهایی میباشد که به دلیل نبود روش غربالگری مناسب یکی از سرطانها با نرخ مرگومیر بالا میباشد. بنابراین یک روش سریع و غیرتهاجمی برای غربالگری سرطان معده بسیار حیاتی است. طیفسنجی رامان به دلیل غیر تهاجمی بودن و نیاز به مقدار کم نمونه یک روش مناسب برای بررسی نمونههای زیستی میباشد.
در این پژوهش با استفاده از طیفسنجی رامان تمایز بین نمونه سرم خون افراد مبتلا به سرطان معده با افراد سالم بررسی شده است. بدین منظور شش نمونه سرم از بیماران مبتلا به سرطان معده و نوزده نمونه از افراد سالم جمعآوری گردید. برای ایجاد تفکیک بین نمونهها از تحلیل تشخیصی حداقل مربعات جزئی استفادهشده است. نتایج اولیه نشان میدهد که %95 بیماران بهدرستی تشخیص داده شدند. این پژوهش نشان میدهد که طیفسنجی رامان ظرفیت خوبی برای تفکیک بین افراد سالم و بیماران مبتلا به سرطان معده را دارد.
-1 مقدمه
در سالهای اخیر سرطان معده یکی از رایجترین سرطانها با مرگومیر زیاد است و نرخ ابتلای افراد جوان به آن بهطورجدی در حال رشد میباشد. سرطان معده چهارمین سرطان ازنظر شیوع در دنیا و دومین سرطان منجر به مرگ در افراد میباشد.[2-1] در کشور ایران، این سرطان اولین سرطان ازنظر مرگومیر در مردان و دومین در زنان است که اگر زود تشخیص داده شود، نرخ نجات از مرگ در بیماران بهطور قابلتوجهی افزایش مییابد. روشهای متداول تشخیص سرطان معده گران، وقتگیر و اغلب تهاجمی هستند.
علاوه بر این، این روشها بسیار وابسته به تجربه پزشک بوده و در بعضی مواقع تشخیص زودهنگام مشکل میباشد. بهمنظور تشخیص بهموقع سرطان معده احتیاج به ترکیب غربالگری اولیه توسط یک روش غیرتهاجمی و پیگیری برای مکانیابی توسط آندوسکوپی میباشد. کشورهای کمی از برنامه غربالگری استفاده میکنند و در اغلب کشورها فقط افراد با ریسک بالا آندوسکوپی میشوند.
بااینکه روش آندوسکوپی دقیقترین روش برای تشخیص سرطان معده است، برای غربالگری گسترده امکان دسترسی به تجهیزات آندوسکوپی و متخصص، حتی در کشورهای توسعهیافته هم جای سوال دارد. بنابراین بعضیاوقات مطالعات باریوم یا تست پپسینوژن سروم بهعنوان روش غربالگری اولیه بکار میرود و پسازآن موارد مشکوک آندوسکوپی میشوند[3] به همین دلیل، نیاز مبرمی به پیدا کردن یک روش سریع و غیرتهاجمی برای تشخیص سرطان معده احساس میشود.
طیفسنجی رامان یک روش اپتیکی بر اساس پراکندگی غیر الاستیک نور از ماده میباشد که میتواند اطلاعاتی درباره نوسانات مولکولی نمونه فراهم کند این روش ازآنجهت برای آنالیز مواد بیولوژیکی مناسب است که این امکان را فراهم میآورد تا انرژی ارتعاشی مولکولها بدون نابودی یا تغییر بافت، تعیین شود و اطلاعات کمّی از ساختار مولکول را فراهم میآورد. از آنجا که طیف رامان متشکل از باندهای تیز با ویژگیهای خاص برای هر مولکول است، یک ماده توسط طیف خاص آن قابل تشخیص است. تفسیر طیف رامان، اطلاعاتی از ساختار، تمرکز و برهمکنش مولکولها در محیطشان بدون نیاز به استخراج ماده فراهم میکند و پتانسیل زیادی برای مطالعات بیوشیمیایی دارد. بهعلاوه در این روش حجم اندکی از نمونه مورد نیاز است.
تشکیل تومور بدخیم و تکثیر سلولهای سرطانی در معده، میتواند اجزای اصلی و محتویات خون را دچار تغییر کند. اگر یک متدولوژی قابلاعتماد بتواند به وجود بیاید، آزمایش خون به چندین دلیل یک روش مرجح برای غربالگری است ازجمله اینکه خون در تمام بدن جریان دارد و نمونهگیری خون، رایج و غیرتهاجمی است. همچنین نمونهگیری و اندازهگیری میتواند بهطور پیوسته در طی فرآیند مانیتورینگ افراد پرخطر یا در حین درمان افراد تشخیص دادهشده، صورت بگیرد. با توجه به امکان وجود تفاوت میان طیفهای بهدستآمده از طیفسنجی رامان خون افراد دارای سرطان معده و سالم، میتوان به امکان تشخیص این بیماری امیدوار بود.
پژوهشی که در اینجا ارائه میشود آنالیز نمونه سرم خون و اجزای آن بهمنظور بررسی سرطان معده با استفاده از روش طیفسنجی رامان میباشد. هدف نهایی، امکان استفاده از طیف رامان بهعنوان وسیلهای برای تشخیص افراد مبتلابه سرطان معده با استفاده از یک طیف مشخص و مقادیر بسیار اندک از نمونه سرم خون میباشد.
-2 روشهای تجربی
-1-2 آماده سازی نمونه
ابتدا 19 نمونه خون از افراد سالم و 6 نمونه از افراد مبتلا به سرطان معده جمع آوری شد. سپس برای جداسازی سرم، نمونههای خون به مدت 10 دقیقه با سرعت 300 دور در دقیقه سانتریفیوژ شدند. پس از آن نمونههای سرم در لولههای آزمایشگاهی از جنس شیشه جهت تست رامان به آزمایشگاه طیفسنجی منتقل شد.
-2-2 چیدمان تجربی
برای اندازهگیریهای میکرو-رامان یک چیدمان بر اساس پراکندگی بازگشتی آماده سازی کردیم. در این چیدمان
طولموج تحریک 532 نانومتر و انرژی تحریک 70 میلیوات است. از یک شیئی 20 برابر کننده برای تمرکز نور روی نمونه و جمعآوری نور پراکنده استفاده شده است. هر طیف از میانگینگیری ده طیف که هرکدام 1 ثانیه جمع آوری شده است به دست آمد.
همانطور که نشان داده شده در این چیدمان باریکه لیزر با شیئی روی نمونه متمرکز میشود، سپس نور پراکنده شده توسط شیئی جمع شده و به آینه دیکروئیک میرسد. آینه دیکروئیک همه پرتوهای پراکنده شده را عبور میدهد و قسمت عمده پرتو فرودی را بازتاب میدهد. برای حذف تمام باریکه فرودی یک فیلتر ناچ بعد از آینه دیکروئیک قرار دادیم. در نهایت باریکه وارد طیفسنج میشود و طیف شکل میگیرد.
-3-2 تحلیل دادهها
برای تحلیل دادهها ابتدا باید زمینه فلورسانس طیفها حذف شوند. بنابراین با بهکارگیری روش چندجملهای یک چندجملهای درجه دوازدهم جهت حذف فلورسانس استفاده شد. سپس شدت قلههای رامان به میانگین مجموع شدتهای طیف نرمال میشود تا دادهها بهنجار شوند . برای تحلیل آماری از تحلیل تشخیصی حداقل مربعات جزئی1 - PLS-DA - که یک روش راهنماییده تحلیل آماری چند متغیره بر پایه روش حداقل مربعات جزئی - PLS - میباشد
برای دستهبندی نمونهها در گروههای مختلف استفاده میشود. روش PLS یک مجموعه گسترده از روشها می-باشد که میتواند با استفاده از یک سری متغیرهای پنهان 2 - LVs - بین یک مجموعه از متغیرهای مشاهده شده ارتباط برقرار کند. در واقع هر LV ترکیب خطی از متغیرهای مستقل - دادههای رامان - میباشد که بیشتر ویژگیهای آنها را دارند.
بنابراین PLS با این متغیرهای جدید که تعداد آنها کمتر از متغیرهای مستقل است یک ارتباط بین متغیرهای مشاهده شده شکل میدهد . در PLS-DA از این ضرایب بهشکلی استفاده میشوند که اختلاف بین دستهها به بیشترین مقدار ممکن برسد. در اینجا دادهها به دو گروه افراد مبتلا به سرطان معده و افراد سالم دسته بندی میشوند. این تحلیل با استفاده از جعبهابزار PLS-DA - ساخت: - Eigenvector Technologies, Inc. در نرمافزار MATLAB انجام شده است.
شکل - a 2 طیف رامان سرم خون همراه با زمینه فلورسانس، خطوط نقطهچین طیف سرم افراد مبتلابه سرطان معده را نشان میدهد. - b طیف رامان فردی سالم و مریض مبتلابه سرطان معده بعد از حذف پسزمینه فلورسانس.
