بخشی از مقاله
چکیده:
قارچهاي فیتوپاتوژن با آسیب به محصولات مهم زراعی از لحاظ اقتصادي و غذایی لطمه جبرانناپذیري به جوامع می زنند از طرفی استفاده بیرویه از سموم شیمیایی باعث به خطر افتادن سلامتی انسان ، آلودگی زیستمحیطی، توسعهي مقاومت پاتوژنها به قارچکشهاوتخریب اکوسیستم شده و از لحاظ اقتصادي نیز مقرون به صرفه نیست.
در این تحقیق وجود کیتیناز نوع C که در واقع موثرترین کیتیناز خانواده 19 و شبیهترین به کیتینازهاي گیاهی است در باکتريهاي جدا شده از خاکهاي مناطق آذربایجان مورد بررسی قرار گرفته بعد از آزمون اثر آنتاگونیستی باکتري مثبت بر روي 2 قارچ بیماریزاي Fusarium oxysporum وAlternaria alternata، باکتري از طریق ژن 16s rDNA شناسایی شده و به عنوان باکتري بالقوه جهت تولید کود بیولوژیک معرفی شده است. از تعداد 106 نمونه خاك جمع آوري شده از مناطق مختلف آذربایجان، تعداد 215 ایزوله استرپتومایسس بر اساس مشاهدات ماکروسکوپی و میکروسکوپی جداسازي شد.
DNA تمامی نمونهها استخراج شد و با استفاده از واکنشهاي زنجیرهاي پلیمراز PCR، ژن کیتینازCخانواده 19 به عنوان نشانگر براي فعالیت ضد قارچی باکتريهاي مطلوب انتخاب و تست آنتاگونیستی بر روي آنها انجام شد. از تعداد 8 ایزوله داراي ژن مورد نظر یکی از ایزولهها فعالیت ضد قارچی قويتري نسبت به دیگر سویهها نشان داد. با استفاده از همسانهسازي و توالییابی ژن 16S rDNAشناسایی و وجود ژن کیتیناز با همسانهسازي این ژن اثبات شد. در نهایت سویه باکتري به عنوان باکتري بالقوه براي سم بیولوژیک تحت عنوان پروبیوتیکهاي گیاهی معرفی شده است زیرا پروبیوتیکها مانع از توسعه میکروارگانیسمها شده واین عمل استرپتومایسس حاکی از عملکرد پروبیوتیکها می باشد.
مقدمه:
قارچهاي فیتوپاتوژن با آسیب به محصولات مهم زراعی از لحاظ اقتصادي و غذایی لطمه جبرانناپذیري به تمام جوامع کشاورزي در سرتاسر جهان وارد میکنند. از طرفی استفاده بیرویه از سموم شیمیایی باعث به خطر افتادن سلامتی انسان ، آلودگی زیستمحیطی، توسعهي مقاومت پاتوژنها به قارچکشها، تخریب اکوسیستمها در سطوح مختلف زنجیرهي غذایی شده و از لحاظ اقتصادي مقرون به صرفه نیست. علاوه بر این قارچهاي پلیفاژي خاکزاد که اغلب عامل بیماري پوسیدگی ریشه درختان میوه به خصوص در مناطق باغی آذربایجان در کشورمان هستند به دللی مقاومت و تعدد منبع تغذیه با روشهاي شیمیایی قابل کنترل نیستند.
به همین دلیل استفاده از اثر آنتاگونیستی میکروارگانیسمهاي مفید با پاتوژنها براي مبارزه با آنها به عنوان روشی بالقوه مطرح می باشد. بیوکنترلها به راحتی قابل تجزیه هستند، آلرژي زایی کمی دارند، در محصولات غذایی انباشته نمیشوند و به راحتی و سهولت در دسترس میباشند. در میان باکتريهاي مفید، جنس استرپتومایسسها به دلیل توانایی بالقوهشان در تولید مواد متابولیکی ثانویه مهم از جمله آنتیبیوتیکها، آنتیفونگال ها و سایر مواد مهم بیوتکنولوژي و صنعتی بسیار مورد توجه هستند.
فعالیت آنتاگونیستی استرپتومایسسها با قارچهاي پاتوژن معمولا مربوط به تولید ترکیبات ضدقارچی و آنزیمهاي هیدرولیتیک می باشد. دیوارهي سلولی قارچها حاوي کیتین است و به نظر می رسد که کیتیناز، آنزیم هیدرولیتیک مهمی در لیز دیوارهي سلولی قارچی می باشد. آنزیم کیتیناز در بسیاري از ارگانیسمها اعم از باکتريها، گیاهان، انسان و حشرات وجود دارد. این آنزیم با هیدرولیز پیوندهاي گلیکوزیدي β - 1→4 - تجزیهي کیتین را کاتالیز میکند. کیتیناز در خانوادهها ي 18 و 19 و 20 گلیکوزیل هیدرولازها طبقه بندي میگردد.
خانوادهي 19 شامل کیتینازهاي گیاهی کلاس I و II و IV و برخی کیتینازهاي استرپتومایسسها هستند که بیشترین فعالیت ضد قارچی را علیه قارچهاي فیتوپاتوژن دارند. این کیتینازها به تناوب در این باکتريها گزارش شده و فعالیت آنتاگونیستی آنها مورد بررسی قرار گرفته است. گزارش شده است که استرپتومایسسها بر قارچهاي بیماريزاي گیاهی نظیر Fusarium oxysporum،Pythinum ultimum،Rhizoctonia solani ،Gaeumanomyces graminis ، Verticillium alboatrum و غیره اثر بازدارندگی از رشد دارند.
معمولترین قارچهاي پوسیدگی ریشه درختان میوه که یک قارچ پلیفاژ هم است و در ایران بخصوص مناطق آذربایجان خسارت فراوانی را به درختان میوه وارد می کند قارچArmillariella mella و Trichoderma viride می باشند. مبارزه با این قارچها بسیار مشکل و در حقیقت غیر ممکن است وفقط با انهدام و سوزاندن درختان میوه بیمار میتوان شیوع آن را کنترل کرد.
بنابراین استفاده از کنترل بیولوژیکی و ایجاد یک سپر دفاعی در اطراف ریشه نهالهاي درختان میوه میتواند مانع از حملات این قارچها بخصوص در نهالهاي نورس درختان بادام و زردآلو شود. به همین منظور در این تحقیق وجود کیتیناز نوع C که در واقع موثرترین کیتیناز خانواده 19 و شبیهترین به کیتینازهاي گیاهی است در باکتريهاي جدا شده از خاکهاي مناطق آذربایجان مورد بررسی قرار گرفته بعد از آزمون اثر آنتاگونیستی باکتري مثبت بر روي 2 قارچ بیماریزا، باکتري از طریق ژن 16srDNA شناسایی شده و به عنوان باکتري بالقوه جهت تولید کود بیولوژیک معرفی شده است.
مواد و روشها:
از شهرهاي آذربایجان شرقی و آدربایجان غربی، بطور تصادفی نمونه برداري شده و از نمونههاي خاك بعد از کد گذاري، رقت تهیه شد و باکتريهاي استرپتومایسس بر اساس مشاهدات ماکروسکوپی و میکروسکوپی جدا شده و DNA ژنومیک از هر سینگل کلونی استخراج شد. آغازگرهاي مربوط به ژن کیتیناز C از روي نواحی محافظت شده ژن کیتیناز در 8 سویه باکتري استرپتومایسس طراحی شده وتکثیر و همسانه سازي و توالی یابی ژن مذکور در تمام ایزولهها انجام شد. باکتريهاي کیتینازc مثبت کشت متقابلی با قارچهایبیماريزاي Fusarium oxysporum و Alternaria Alternata داده شد و بررسیهاي آنتاگونیستی باکتري علیه قارچهاي بیماریزا انجام گرفت. فعالترین سویه از لحاظ اثرآنتی فونگال انتخاب شده و با استفاده از تکثیر و توالییابی ژن 16s rDNA شناسایی شد. این باکتري به عنوان باکتري داراي پتانسیل بالقوه کود بیولوژیک معرفی گردید.
شکل:1 بررسی فعالیت آنتاگونیستی ایزوله هاي داراي کیتیناز بر علیه قارچ هاي بیماریزاي گیاهی
نتایج وبحث:
حدود 106 نمونه خاك از مناطق مختلف آذربایجانغربی و شرقی جمعآوري گردید. از نمونه خاكها رقتهاي سریالی -1 10، 10 -2 و 10 -3 تهیه شد و بررسی pH خاك ها در رقت اول انجام گرفت نمونه خاکها اثراًک قلیایی بوده pHبالاي 7 داشتند. باکتریهاي مورد نظر در خاکهاي قلیایی بیشتر وجود داشتند . بهترین رقت جهت جداسازي ایزوله رقت دوم است. از نمونه ي خاکها،215 ایزوله جداسازي شد.
بعد از استخراج DNA و انجام واکنشهاي PCR تنها در 8 ایزوله از 215 ایزوله ژن مذکور تکثیر شد. قطعه هدف بخشی از ژن به طول 500 bp بود. در بررسی آنتاگونیستی سویههاي داراي کیتیناز بر علیه قارچهاي بیماریزاي گیاهی ایزوله SchA3 در بین این سویهها بیشترین بازدارندگی را بر علیه قارچهاي بیماریزا اعمال نمود. به همین دلیل ژن کیتیناز و ژن 16S rDNA این ایزوله براي همسانهسازي و توالییابی انتخاب شد. نتایج توالییابی با نرمافزارهاي بیوانفورماتیکی مورد پردازش و بززسی قرار گرفت. بعد از تایید وجود ژن کیتیناز مورد نظر و شناسایی دقیق سویه مورد نظر ایزوله مذکور به عنوان باکتري با پتانسیل کود بیولوژیک معرفی شد.
شکل:2 تکثیر قطعه هدف از ژن رمزگردان آنزیم کیتینازC
