بخشی از مقاله
چکیده :
R. solanacearum یک بیمارگر گیاهی خاکزاد است که از طریق زخم یا ریشه وارد میزبان شده و بافتهاي هوایی گیاه را کلونیزه میکند. این باکتري به میزان قابل توجهی پلی ساکارید خارج سلولی - EPS - تولید میکند. EPS ترکیبی با وزن مولکولی بالاست که به صورت یک لایه سیال و چسبناك در اطراف سلول باکتري تشکیل میشود.
در این تحقیق، نقش EPS در ماندگاري باکتري در خاك و همچنین جمعیت آن در فراریشه گوجه فرنگی بررسی شد. به منظور تعیین نقش EPS در ماندگاري باکتري در خاك و جذب آن به ریشه گوجهفرنگی، علاوه بر جدایه تیپ وحشی از موتانت ناقص در تولید EPS نیز استفاده شد. نتایج این تحقیق نشان داد که EPS نقشی در ماندگاري باکتري در خاك ندارد. همچنین اختلاف معنیداري بین جمعیت جدایه تیپ وحشی و موتانت ناقص در تولید EPS در فراریشه مشاهده نشد. با توجه به نتایج بدست آمده، به نظر میرسد EPS نقشی در جذب باکتري به ریشه گوجهفرنگی ندارد.
مقدمه
گوجهفرنگی - Lycopersicum esculentum - محصول اقتصادي مهمی است که امروزه در 170 کشور دنیا از مناطق آب و هوایی مختلف، کشت میشود. عوامل متعددي مانند آفات، بیماريهاي قارچی، باکتریایی و ویروسی، رقابت با علفهاي هرز و شرایط آب و هوایی و خاکی نامساعد سبب کاهش بازدهی در تولید گوجهفرنگی میشوند. آفات و بیماريهاي گوجه فرنگی اغلب با آفات و بیماريهاي سایر گیاهان خانواده سیبزمینیان مانند بادمجان و توتون مشترکند
بیماري پژمردگی باکتریایی که توسط باکتري R. solanacearum ایجاد میشود، یک بیماري معمول در مناطق گرمسیري و نیمهگرمسیري دنیاست. این باکتري دامنه میزبانی وسیعی دارد و به بیش از 450 گونه گیاهی شامل محصولات مهم اقتصادياي مانند گوجهفرنگی، توتون، سیبزمینی، بادام زمینی و موز حمله می کند. این باکتري یک بیمارگر خاکزاد است که از طریق زخم یا محل ظهور ریشههاي فرعی وارد گیاه میشود. بیمارگر در ابتدا کرتکس ریشه میزبان را کلنیزه میکند، سپس وارد پارانشیم آوندي میشود و در نهایت آوندهاي چوبی را مورد تهاجم قرار میدهد
پلیساکارید خارج سلولی - EPS - ترکیبی با وزن ملکولی بالاست که به صورت یک لایه سیال و چسبناك در اطراف سلول باکتري تشکیل میشود که بیش از 80 درصد آن از گالاکتوزامین تشکیل شده است. گلوکز و رامنوز از دیگر قندهاي موجود در این ترکیب هستند. این ترکیب به مزانی نسبتاً قابل توجهی توسط باکتري R. solanacearum تولید میشود . - 1 - به منظور بررسی نقش EPS در بقاي باکتري، جمعیت جدایه تیپ وحشی و موتانت ناقص در تولید EPS در خاك و فراریشه مقایسه شد.
مواد و روشها
جدایه باکتریایی و شرایط رشد
از یک جدایه تیپ وحشی - Rs130 - و یک موتانت ناقص در تولید EPS جهت انجام آزمون استفاده شد. جهت آماده سازي اینوکولوم باکتري، جدایههاي مورد نظر از سوسپانسیون فریز شده محیط کشت مایع LB بر روي محیط کشت SPA کشت و در دماي 25 درجه سانتیگراد قرار گرفت. سوسپانسیون باکتریایی با استفاده از آب مقطر استریل تهیه و غلظت مناسب آن با برابر با 108 سلول باکتري در گرم خاك با اندازه گیري ضریب جذب نوري در طول موج 600 نانومتر تهیه شد. به منظور ردیابی و اندازهگیري تعداد باکتري در خاك و ریزوسفر از محیط کشت نیمهانتخابی SMSA استفاده شد . - 10 - موتانت ناقص در تولید EPS با ایجاد جهش در ژن کدکننده آن، از جدایه Rs130 ایجاد و در آزمون هاي مربوطه استفاده شد
رشد گیاه و مایه زنی
بذرهاي گوجهفرنگی - Lycopersicum esculentum - رقم Queen مورد استفاده قرار گرفت. جهت کاشت گوجهفرنگی، بذرها یک دقیقه بوسیله اتانول 70 درصد و به دنبال آن چهار دقیقه بوسیله هیپوکلریت سدیم نیم درصد - ده درصد تجاري - ضدعفونی و پس از آن دوبار بوسیله آب شسته شدند. سه هفته پس از کاشت بذور، نشاهاي سه هفتهاي در گلدانهاي2/5 کیلوگرمی حاوي خاك ضدعفونی شده، کاشته شد.
جهت تعیین بقاي R.solanacearum درخاك، مایهزنی به خاك با غلظت 108 cfu در گرم خاك انجام شد. جدایه تیپ وحشی و موتانت ناقص در تولید پلی ساکارید خارج سلولی مورد آزمون قرار گرفتند. براي هریک از جدایههاي مورد نظر چهار تکرار بکار گرفته شد.
نمونه برداري از خاك در فواصل زمانی مختلف پس از مایه زنی، انجام شد. یک گرم از خاك برداشته و با استفاده از آب مقطر سترون، سريهاي رقت تهیه شد و سوسپانسیون مورد نظر روي محیط کشت نیمهانتخابی SMSA قرارگرفت و با دقت بر روي آن پخش شد محیط کشتها در دماي 25 درجه سانتیگراد قرار گرفت و پس از 72 ساعت پرگنههاي ظاهر شده بر روي محیط کشت، مورد بررسی قرار گرفت 10 - و . - 8 جهت تعیین بقاي R.solanacearum در فراریشه، مایهزنی به خاك با غلظت 108 cfu در گرم خاك انجام و پس آز آن نشاهاي مورد نظر در خاك کاشته شدند. براي هریک از جدایههاي مورد نظر در هر نمونه برداري، چهار تکرار بکار گرفته شد.
جهت تعیین تعداد باکتريهاي موجود در فراریشه، نمونه برداري در روزهاي مختلف تا 21 روز پس از مایهزنی انجام شد. بدین منظور، پس از آنکه ریشه با دقت و به آرامی از خاك بیرون آورده شد، با تکانهاي سریع در عرض چند ثانیه، خاك اطراف ریشه جدا شد. سپس ریشهها در ظرفی هک قبلاً وزن شده به مدتیک دقیقه در آب مقطر سترون شسته میشوند. پس از کشت و نگهداري محیط کشتها در انکوباتور، شمارش پرگنه با استفاده از روش سري رقت و با استفاده از محیط کشت نیمه انتخابی SMSA انجام شد. محیطکشتها به مدت 72 ساعت در دماي 25 درجه سانتیگراد قرار گرفتند تا پرگنهها ظاهر شود
نتایج
بقاي R .solanacearum در خاك
به منظور بررسی میزان ماندگاري باکتري در خاك و همچنین بررسی نقش پلیساکارید خارج سلولی، جدایه تیپ وحشی و موتانت ناقص در تولید EPS در طول یک دوره شش هفته اي بررسی شد. شش هفته پس از مایه زنی، میزان کاهش در غلظت اولیه اینوکولوم مورد بررسی قرار گرفت. با توجه به نتایج بدست آمده، اختلاف معنی داري بین جدایه تیپ وحشی و موتانت ناقص در تولید EPS مشاهده نشد.
جمعیت R .solanacearum در فراریشه
به منظور بررسی جمعیت باکتري در ریزوسفر، جدایه تیپ وحشی و موتانت ناقص در تولید EPS در یک دوره زمانی سه هفته اي مورد بررسی قرار گرفت. با توجه به دادههاي بدست آمده، اختلاف معنی داري در روزهاي هفتم و چهاردهم پس از مایه زنی، بین موتانت و جدایه تیپ وحشی مشاهده نشد.
بحث
آگاهی از مدت و میزان ماندگاري باکتري در خاك، در مدیریت بیماري از طریق روشهاي زراعی مانند تناوب با گیاهان غیرمیزبان، نقش بسزایی دارد. با توجه به نتایج بدست آمده، به نظر میرسد که باکتري قادر است که در یک دوره زمانینسبتاً طولانی در خاك باقی بماند که این مسئله مطابق است با نظر Duske و همکاران - 1965 - که با توجه به افت شدید در میزان محصول گوجهفرنگی، احتمال بقاي طولانی مدت بیمارگر در خاك را بدون حضور میزبان مطرح کردند
همچنین با توجه به اینکه ماندگاري جدایه تیپ وحشی تفاوتی با موتانت ناقص در تولید پلی ساکارید خارج سلولی ندارد، می توان استدلال کرد که پلیساکارید خارج سلولی نقشی در ماندگاري باکتري در خاك ندارد. گزارش Saile و همکاران - 1997 - نیز تفاوتی در ماندگاري جدایه AW1-1 - جدایه ناقص در تولید پلیساکارید خارج سلولی - با AW1 - جدایه تیپ وحشی - در خاك نشان نداد
