بخشی از مقاله
ويژگيهاي پروكسيد ساكن در سازه هاي پلي آنيلين
چكيده :
از لحاظ علم شيمي پلي آنيلين هاي تركيبي براي ساكن سازي پروكسيدها (HRP) بعد از فرايند فعال سازي مورد استفاده مورد استفاده قرار مي گرفت . آنزيم هاي ساكن نسبت به آنزيم هاي آزاد كه تحت تأثير حلال هاي ارگانيك (اتانول ، استون و استونيتريل) قرار دارند عملكرد بهتري از خود نشان مي دهند (بالاي 10%)
HRP ساكن شده همچنين وقتي تحت تأثير روش گرمايي با ضريب گرمايي قرار دارند نيز عملكرد بهتري نسبت به آنزيم ها نشان مي دهد . ميزان PH آنزيم هاي ساكن و آزاد نشانگر واكنش هاي يكساني است . هر چند PANIO-HRP نشانگر ضريب بالاي قليايي (بين 9.0-11) و ضريب جايگزيمي حداكثر PH در حدود دو Wcat.app و km.app و Kcap و Km مشاهده شد . آنزيم هاي ساكن شده نشان دهنده Km-app معادل 5.20mm0l-1 و آنزيم هاي آزاد معادل بدون اسيد پيروگالل مي باشد .
مقدمه :
آنزيم هاي ساكن شده به عنوان موضوع تحقيقات روي فن آوري آنزيم ها در كاربردهاي صنعتي مزاياي بسياري دارند . [1,2] . مزاياي عملياتي اين آنزيم ها شامل : قابليت استفادة مجرد ، اشتقاق سريع ، كنترل شكل گيري و جداسازي سريع از ميانگين بازخورد مي باشد .
روش هاي متعددي براي ساكن سازي آنزيم ها به عنوان روش هاي حمايتي وجود دارد . روش ها وحمايت ها براي ساكن سازي آنزيم هاي خاصي كه براي اطمينان از فعال بودن آنزيم هاي به هم پيوسته مورد استفاده قرار مي گيرد انتخاب مي شوند . بنابراين فعاليت آنزيم هاي به هم پيوسته ممكن است از صفر تا بالاترين حد بر اساس موفقيت فرايند ساكن سازي متفاوت باشد .
پلي انيلين يك پليمر محيطي بادوام با ويژگيهاي فيزيكي و شيميايي است كه در سالهاي اخير به ويژه به دليل رسانايي الكتريكي ديگر پليمرها كه در ساختار سنسورها استفاده مي شود مورد توجه قرار داشته است .
در كنار اين ويژگيهاي جالب از لحاظ علم شيمي پلي انيلين هاي تركيب شده ممكن است مثل يك سازة پليمري مناسب با توجه به ويژگيهاي شيميايي از قبيل دسترسي آسان ، تركيب پذيري بالا ، مقاومت بالا در مقابل دما و PH و مقاومت در برابر ميكروارگانيسم ها ، مورد استفاده قرار گيرد .
اخيراً عملكرد بعضي پليمرهاي خانوادة PANI را در ساكن سازي پروكسايدهاي (HRP) گزارش كرده ايم .
در اين مقاله ويژگيهاي ساختار ساكن شده را كه با آنزيم هاي آزاد از جمله ظرفيت واكنش با تركيب هاي اوليه ، پايداري سازه هاي ساكن در مقابل PH و تغييرات دما ، مقاومت عملياتي ساختار و پارامترهاي كيفي Km و Kcat كه نشان دهندة عملكرد بهتر آنزيم هاي ساكن شده هستند مقايسه شده اند گزارش كرده ايم .
مواد و روشها :
1-2-عامل ها :
HRP نوع دو بوسيله شركت شيميايي سيگما خريداري شده و تحت شرايط خلاء تقطير شد تا اينكه مايع بي رنگي بدست آمد . همه عامل هاي ديگر آناليز شده و بدون تصفيه مجدد مورد استفاده قرار گرفتند . محلولها بوسيله آب ديونيزه مهيا شدند.
2-2-پلي آنيلين هاي (PANI) از طريق اكسيداسيون شيميايي محلول 0.44moll-1 و محلول آمونيوم پورسولفات 0.68 سنتز مي شود . PANI متعاقباً بعد از روشي كه توسط السن و اگرن [11] تشريح شده در اين روش 2.5% محلول گلوتاراديد در فسفر بافر آماده شده است و محلول در حالت رفلاكس قرار گرفت .
3-2-ساكن سازي آنزيم ها و آزمايش ها :
فرايند ساكن سازي HRP از طريق اضافه كردن 1.0ml محلول آنزيم (Eu162) كه در فرآوري شده ، انجام مي پذيرد . اين محلول به مدت 2 ساعت در دماي تحريك شده و سپس مادة جامد بوسيله كاتاليزور و رشته مي شود . تا آنزيم هاي غير واكنش زا را از روي آن پاك كند . آنزيم هاي فعال كه اين وظيفه را به عهده دارند از طريق فرايند آزمايش فعاليت آنزيمي بعد از روش هالپين تست مي شود .اين آزمايش در دماي ( ) اتاق با استفاده از پيروگالل و به عنوان تغيير دهندة سرعت واكنش
انجام مي شود . اين نوع آزمايش هاي نمونه با اضافه كردن به فسفات بافر با PH 6.0 محتوي پيروگالل صورت مي گيرد . واكنش روي مي دهد و بعد از يك دقيقه نتيجة آزمايش در 420nm ارزيابي مي شود . آزمايش هاي مربوط به آنزيم هاي ساكن شده در شرايط مشابهي انجام مي
پذيرد . به جز فرايند واكنش كه تحت شرايط تحريك و با جداسازي PANIG-HRP از محلول ، بوسيله فرايند تصفيه از طريق بافر انجام مي پذيرد . يك سري از فعاليت پروكسايدها با تشريح تغييرات در ميزان جذب در مقياس 420m در دقيقه صورت مي گيرد. مقادير بدست آمده درازمايش بدون واكنش كه بوسيله هيدروژن پروكسايد يا پليمر ها ايجاد مي شود براساس اين ارزيابي كاهش يافته است. همه آزمايش ها در سه مرحله انجام مي گيرد نتايج به صورت ميانگين وانحراف معيار نشان داده مي شود.
ظرفيت HRP ساكن شده براي تشخيص مقادير كاهش يافته آن به وسيله Catechof[13] گوياكل (14) فونل(15) ديناسيدين (16) هيدروكونن ورسيوسينل (17) صورت مي گيرد. هيدروژن پروكسايدي به عنوان كاتاليزور اكسيد شده براي همه تست انجام مي شود.
4.2 ويژگيهاي HRP ساكن شده:
برخي از اين ويژگيهاي در مقايسه با آنزيم هاي طبيعي آزمايش شده اند.
2.4.1 حداكثر PH
واكنش هاي PAN16-HRP با تغيير بافر محلول به شرح زير است.
1) 0.1 mol و 0.2 MOL –1 پتاسيم فسفات براي 3.0;1mol 1-1 , PH2.0 براي PH4.6 تا PH 8.0 و 0.2 mol1-1 يا سديم بورات براي PH9.0-11
24.2 حداكثر دما و مقاومت در برابر گرما
دماي حداكثر با حرارت دادن PAN16-HRP در وان آب گرم به مدت 1 دقيقه در دماي 90-30 مشخص مي شود. بعد از اين مرحله واكنش با اضافه كردن محلولي كه قبلا گرم شده شروع مي شود مقاومت در برابر گرما ازطريق دماي (55c) و تعليق در فسفر بافر 0.1 mol 1-1 آزمايش مي شود. سپس محلول فورا به شكل يخ در مي آيد و براي آزمايش پايداري آماده مي شود.
24.3 فعاليت متوسط ارگانيك
فعاليت مستقيم با وجود محلول هاي ارگانيك (متانول 1تانول واسترنتريل) كه تمركز آنها در آزمايش نهايي از 5-20% viv درجه بندي ميشود.
24.5 بررسي ساختارهاي ميكل –منتن
اين بررسي از طريق تغيير تمركز پيروگالل از صورت مي‌گيرد.
نتيجه و بحث:
ويژگيهاي ساختار PAN16-HRP
اين ساختارقادر بود همه كاتاليزور هاي آزمايش شده اي را كه بوسيله HRP به همراه هيدروژن پروكسايد اكسيد مي شوند اكسيد نمايد. واكنش پذير در مقابل اين مواد همانگونه كه در مورد اين آنزيم انتظار مي رفت بسيار متفاوت بود. واكنش پذيري PAN16-HRP در مقابل پيروگالل فنول و كاتكل بسيار شبيه واكنش پذيري آنزيم ها آزاد بود. نتيجه آنزيم متوكسليت روي PAN16.HRP نشان داده شده و احتمالي 12/1.13/3% خطا در نتيجه واكنش به چشم خورد.
در قياس با HRP آنزيم ساكن شده واكنش پذيري پايين در مقابل ري سرسينول و هيدروكوئين نشان ميدهند. به علاوه شكل گيري محصول بدون اضافه كردن هيدروژن پروكسايد مشاهده مي شود.
رشد كلي وقابل توجهي در آنزيم ها ساكن شده در فرايندي كه به واسطه افزايش PH وگرما روي مي دهد مشاهده مي شود. هر چند آنزيم هاي ساكن و طبيعي در آزمايش PH منحني هاي بسيار مشابهي نشان ميدهند. PAN16.HRP فعاليت بالايي به ويژه در درجه قليايي نشان ميدهد.
ساختار طبيعي آنزيم ها و PAN16.HRP تفاوت نسبي در منحني گرمايي نشان ميدهند. آنزيم هاي طبيعي منحني توپي شكل نشان ميدهند كه داراي حداكثر افزايش دما است. از سوي ديگر PAN10-HRP نشانگر صددرصد فعاليت در دماي 60C است كه بعد از آن به آرامي اين دما كاهش مي يابد.
و به ميزان 20 درصد فعاليت در دماي c 80 مي رسد.
نمودار ها نشان مي دهند منحني مقاومت گرمايي آنزيم هاي ساكن و آزاد در دماي 55c مي باشد. مقاومت گرمايي HRP شناخته شده و استفاده از آن به عنوان شاخص فرايند فتوسنتز
پيشنهاد شده است. مقاومت اين آنزيم در برابر نوسان گرمايي به ساختار آن در ارتباط است. همانطور كه در نمودار ها ديده مي شود. منحني خاموشي آنزيم ها ساكن و فعال شبيه مقاديري است كه توسط ونگ اتال بدست آمده است بايد اشاره كرد كه مقاومت گرمايي PAN16-HRP بهتر از سيستم طبيعي است.وجود ايزوآنزيم‌هاي با مقاومت گرمايي متفاوت باعث وجود منحني هاي با دو فاز متفاوت واكنش ميشود.
مقاومت HRP با وجود چند محلول ارگانيك و تركيبي بسيار ويژه اي است . كه در مورد اين آنزيم به آن اشاره شده است. در كنساتراسيون پايين تر از 7/107 آنزيم هاي سكان و آزاد.واكنش هاي مشابهي در براي بر اتانول و استون نشان دادند كه احتمالا به دليل اين فرايند حلال ها براي استفاده مي مانند فعاليتها در كنسانتراسيون 20% محلول هاي ارگانيك در نمودار 1 نشان داده
شده اند. اين واكنش احتمالا نتيجه ظرفيت بيشتر پليمرها براي نگهداري محلول ارگانيك در سطح است كه باعث ايجاد محيطي هيدرات شده براي كاتاليز آنزيم ها است.مقاومت PAN16-HRD تا حدودي با دو محلول ديگر قابل قياس است. هر چند هنوز فعاليتي بالاتر از آنزيم هاي آزاد دارد.
اصولا چند نمونه HRP ساكن شده با مقاومتي بين 5 روز 6 ماه دارند. در اين آزمايش شرايط ساكن سازي و ذخيره سازي با مقاومت HRP در ارتباطند. فعاليت هاي بعد از مرحله ذخيره سازي ادامه مي يابند وآنزيم هاي آزاد در نمودار 2 نشان داده شده اند.
تاثير ساكن سازي بر پارامترهاي كينتيك Kcat/Kcta.pp, km/hm.app نيز مورد مطالعه قرار گرفته است. نتايج بدست آمده با استفاده از پيروگالل به عنوان ماده اصلي در نمودار 3 نشان داده شده است. رابطه بين سرعت شكل گيري محصول (پورپورگالين) وكنسانتراسيون ماده اصلي اغراق گونه است كه در طرح دوگانه لاين ويور- برك (نمودارها) نشان داده شده است.
اشاره به اين موضوع مهم است كه اين ارزيابي ها در PH6.0 انجام گرفته اند در حاليكه حداكثر PH براي HRP آزاد 8.0 مي باشد. آنزيم هاي آزاد همانطور كه انتقال مي رفت عملكرد بهتري دانند. گذشته از اين مشاهدات نتايج نشانگر ويژگيهاي قابل توجهي در سيستم PANI6-HRP مي باشد.
فرايند ساكن سازي و در نتيجه پليمرها. در ساختار آنزيم ها وپيروگالل ندارند. كه باعث مي سوزد Km.app بعداز مرحله ساكن سازي تغيير كمي بپذيرد. حركت محدود آنزيم كه ناشي از فرايند ساكن سازي است عواملي چون ميزان پايين ماده اوليه از قسمت بالا گرفته تا سطح آن در نتيجه آزمايش تاثير بگذارند. به اين وجود ويژگيهاي ساختار PANIG-HRP به وضوح افزايش يافت كه اين مساله با توجه به معيارهاي Keat-app تشريح شده كه نشان مي دهد عملكرد بهتر آنزيم هاي ساكن شده با آنزيم هاي فعال مقايسه شده اند.
4.نتيجه گيري :
در اين آزمايش نشان داديم پيوستگي عناصر HRP به پلي آنيلين منجر به افزايش مقاومت اين آنزيم ودر نتيجه افزايش پارامترهاي مقاومت از جمله مقاومت گرمايي. مقاومت در برابر PH بالا و مقاومت در طي فرايند ذخيره سازي مي شود. DAN10-HRP باعث فعاليت آنزيم ها در كنار حلال هاي ارگانيك متل اتانول ، واستونتريل مي شود. در اين صورت پليمر به نظر مي رسد نقش بسيار مهمي درايجاد لايه هاي حلال داشته باشد.
پارامترهاي كنتيك نشان دهنده عملكرد مناسب سيستم ساكن شده در مقايسه با آنزيم هاي آزاد هستند. لازم به اشاره است اختلاف بسيار كمي در معيارهاي Km,Km-app مشاهده شده و عملكرد بهتر آنزيم هاي ساكن شده ملاك ارزيابي معيارهاي Kcat-app مي باشند.
