بخشی از مقاله
چکیده
مقدمه: بیماریهاي قلبی – عروقی اولین و مهمترین عامل مرگ میر در جهان است.اصلی ترین شیوه درمان این اختلالات ، استفاده از عوامل ترومبولیتیک است . استرپتوکیناز - - SK متداولترین دارو در درمان اختلالات ترومبولیتیک در کشورهاي در حال توسعه میباشد. این پروتئین باکتریایی توسط گروه هاي G,C,A استرپتوکوك ترشح میشود.
به علت عدم تولید توکسین تب زا، ژن مربوط به SK تجاري از سویه S. equisimilis H46 A گروه C استخراج میشودبا توجه به هتروژنیسیته ژن SK ؛جستجوي سویه هاي جدید جهت تولید انواع نوترکیب با ویژگیهاي مناسب ارزشمند خواهد بود. در تحقیق حاضر ژن استرپتوکیناز از یک سویه استرپتوکوکی گروه C جدا شده از نمونه هاي بالینی پس از غربال گري فعالیت آنزیمی استخراج و در E.coli بیان و پس از تخلیص فعالیت بیولوژیک آن بررسی و با سویه تجاري مقایسه شد.
مواد و روشها : فعالیت سنجی استرپتوکیناز ترشحی سویه هاي جمع آوري شده بیماریزاي ایران با استفاده از تست کازئینولیز انجام و سویه گروه C مناسب انتخاب شد. ژن مربوطه پس از استخراج و تکثیر در پلاسمید pQE30 کلون گردید، سپس در E.coli M15 بیان شد.پروتئین نوترکیب با وسترن بلات تایید و با استفاده ازکروماتوگرافی تمایلی تخلیص شدودر نهایت فعالیت بیولوژیک آن به روش کمی کروموژنیک - - s2251 بررسی شد.
بحث و نتیجه گیري: پلاسمید pQEskg پروتئین کامل را بیان کرده وبه دلیل برچسب هیستیدینی در طی یک مرحله براحتی تخلیص میشود. فعالیت استرپتوکیناز نوترکیب حاصله از سویه بومی بسیار نزدیک به سویه تجاري است. مقایسه سایر پارامترهاي آنزیمی وایمونوژنیسته مرحله بعدي خواهد بود.
مقدمه:
تشکیل لخته خونی - ترومبوز - در سیستم گردش خون موجب مسدود شدن رگها میشود که در اکثر مواردبا معلولیت و مرگ بیمار همراه است.اصلی ترین شیوه درمان این اختلالات ، استفاده از عوامل ترومبولیتیک است . - 1 - این دسته از داروها موجب فعال شدن پلاسمینوژن و تبدیل آن به سرین پروتئاز فعالی به نام پلاسمین میشوند و شامل فعال کننده پلاسمینوژن بافتی - tissue plasminogen activator - tPA و انواع کوتاه شده آن ،استرپتوکیناز SKو استافیلوکیناز - SAK به ترتیب پروتئین ترشحی استرپتوکوکی و استافیلوکوکی - و یوروکیناز UK میباشند - - 2 که از نظر بالینی tPA و SKپر مصرفترین و متداولترین آنها ست.مطالعات کارآزمایی بالینی متعددي در مورد مقایسه اثر SK, tPA انجام شده است.
اما تاکنون گزارشی واضح و قطعی مبنی برارجحیت هیچیک از آنها وجود ندارد - . - 3 استرپتوکیناز تنها داروي تایید شده در درمان انفارکتوس حاد قلبی و سایر بیماریهاي ایسکمیک است. به دلیل اهمیت آن تحقیقات گسترده اي جهت بهینه سازي تولید و عملکرد آن در حال انجام است. استرپتوکیناز پروتین ترشحی 414امینو اسیدي است که توسط استرپتوکوکهاي بتا همولیتیک گروه C,A وG تولید میشود.استرپتوکیناز به منظور مصارف درمانی، ابتدا از محیط کشت سویه S. equisimilis H46A GCS جداسازي میشد.
این سویه ازسال 1947 به دلیل تولید بهتر استرپتوکیناز و عدم ترشح توکسین اریتروژنیک در محیط کشت نسبت به سایر سویه ها از بین چندین سویه GCS انتخاب شد. امروزه بدلیل بازدهی اندك ، قیمت بالاي محیط کشت استرپتوکوك ونیز آسیب میوکاردیوم ناشی از باکتریوهمو لیزین ، تولید نوترکیب SK با استفاده از ژن مربوط به این سویه - skc2 - در میزبانهاي مختلف باکتریایی و مخمر انجام میشود . اغلب مطالعات انجام شده به منظور افزایش تولید و یا بهبود خصوصیات پروتئین شامل بهینه سازي شرایط تولید و موتاسیون skc2 می باشد.
گزارشات متعددي در مورد هتروژنیسیته ژن استرپتوکیناز و اثر آن در فعالیت و میزان تولید وجود دارد به نحوي که برخی سویه فعالیت استرپتوکینازي بیشتري را نشان میدهند - . - 6-5 افزایش کاربردهاي استرپتوکیناز و از سویی هتروژنیستی این ژن ما را بر آن داشت تا سویه هاي تولید کننده استرپتوکیناز جدا شده از نمونه هاي بالینی را به منظور یافتن سویه جدید و بومی غربال گري کنیم . غربال گري سویه ها امکان بررسی طیف وسیعی از توالی هاي تاثیر گذار در فعالیت و تولید را بوجود میآورد و سویه جدید پس از شناسایی میتواند به عنوان منبع جدید در تولید استرپتوکیناز به صورت صنعتی بکار برده شود.
مواد و روش ها:252 ایزوله استرپتوکوکی در طی یکسال از مراکز مختلف گردآوري وسپس با استفاده از تستهاي اختصاصی میکروبی و بیوشیمی مورد شناسایی قرار گرفت - . - 7 جهت تایید گروه هاي استرپتوکوکی بر اساس دسته بندي لنسفیلد از آنتی سرم اختصاصی Maststrep.UK - - استفاده شد. به منظور غربال گري ، سویه هاي استرپتوکوکی گروه GCS شناسایی شده و سویه استاندارد H46A GCSدر محیط Todd –Hewitt کشت داده شد و سوپرناتانت آنها فاز لگاریتمی با سانتریفیوژ در4°Cجداسازي شد.
ارزیابی فعالیت استرپتوکوکی به روش نیمه کمی Agarose/casein/plasminogen plate انجام شد - . - 8 اساس این روش مشاهده قدرت پروتئولیز پلاسمین انسانی در برابر کازئین می باشد .نتایج تست کازئینولیز بر اساس قطر هاله شفاف اطراف هر چاهک بررسی و میزان فعالیت به صورت کیفی با مقایسه آن با محلول استرپتوکیناز تجاري و سویه استاندارد انجام شد و بر این اساس سویه تولید کننده و داراي فعالیت بهتر شناسایی شد. DNA سویه منتخب GCS –S87 و سویه استاندارد استخراج شد وژن استرپتوکیناز با استفاده از پرایمرها داراي توالی اختصاصی برش دو آنزیم محدود الاثر BamH I, Pst I تکثیر شد و پس از هضم آنزیمی در پلاسمید بیانی PQE30 کلون و با تعیین توالی و آنالیز آنزیمی تایید شد.
کلون در PQE30 موجب افزوده شدن برچسب 6xHis در انتهاي آمینی پروتئین میشود که علاوه بر شناسایی پروتئین با استفاده از آنتی بادي اختصاصی علیه 6xHis ،موجب تسهیل در خالص سازي پروتئین به روش کروماتوگرافی تمایلی خواهد شد. سازه هاي تایید شده به میزبان هاي متفاوت ترانسفرم و شرایط و میزبان مناسب جهت بیان پروتئین هاي نوترکیب بهینه سازي شد.
پروتئینهاي حاصله پس از بیان درشرایط یکسان با استفاده از Ni-NTA Agarose به روش دناتوره تخلیص شد و در شرایط کنترل شده مراحل حذف بافرهاي دنا تورانت و فولدینگ مجدد استرپتوکیناز انجام شد. مراحل بیان و تخلیص با SDS-pageبررسی شد و در نهایت پروتئین هاي حاصله با روش وسترن بلاتینگ مورد تایید قرار گرفتند.جهت تعیین میزان فعالیت آنزیمی از روش دقیق و حساس کروموژنیک استفاده شد.در این روش از پلی پپتید صناعی Val-Lue-Lys-p- nitrophenolبه عنوان سوبستراي پلاسمین استفاده میشود و میزان تولید محصول در طول موج 405nm بررسی میشود - . - 9
نتایج و بحث : از میان نمونه هاي بالینی حدود 74 سویه تولید کننده استرپتوکیناز شناسایی شد که % 13.5 آنها شامل گروه GCS و مابقی GAS ,GGS را شامل میشوند .در غربال گري اولیه اغلب سویه هاي GCS فعالیت استرپتوکینازي کمتري نسبت به S. equisimilis H46A داشتند وتنها یک سویه در چند بار تکرار تست ، هاله لیز مشابه با استاندارد نشان داد. نتایج تکثیر ژنی و تایید پلاسمید داراي قطعه در تصویر 1 آمده است و نشاندهنده یکسان بودن طول ژن در سویه هاي مختلف است . بیشترین بیان در میزبان E.coli M 15و میزان و غلظت IPTG 0/5 mM به مدت 5 ساعت پس از القا بدست آمد.
تصویر 2 ژل اکریل آمید مربوط به قبل و بعد از بیان مربوط به استرپتوکیناز H46A و GCS –S87 میباشد که هر دو داراي باندي در حدود 47 کیلو دالتون دارند. پروتین هاي نوترکیب با استفاده از روش کروماتوگرافی تمایلی خالص سازي شدند که نتایج آن در شکل 3 آمده است. وسترن بلاتینگ صحت پروتئینهاي بیان شده را تایید میکند.نتایج نشان داده نشده است.
