بخشی از مقاله
چکیده
سرده سیر از جنس گیاهان گلدار تک لپهاي داراي ترکیبات گوگردي است که از اسید امینهاي به نام آلیین حاصل میگردد. آلیین سوبستراي آنزیم آلیناز است که در اثر فعالیت این آنزیم به آلیسین، پیروات و آمونیوم تبدیل میگردد. این مطالعه، نخستین گزارش در رابطه با شناسایی و توالییابی ژن آنزیم آلیناز دخیل در مسیر بیوسنتز آلیسین در تعدادي از گونههاي Allium است.
تعداد شش گونه Allium A. stipitatum, A. atroviolaceum, A. fistolosum, A. umbellicatum, A. lenkoranicum - - rubellam, از نقاط جغرافیایی مختلف ایران از مرکز ملی ذخایر ژنتیکی و زیستی ایران تهیه شدند. مطالعات روي پنج گونه دیگر - Allium sativum, A. ascalonicum, A. chinensis, A. macrostemon, A. tuberosum - از طریق دادههاي SRA انجام گرفت.
شناسایی ژن با استفاده از دادههاي حاصل از نتایج توالییابی نسل بعدي و سپس توالی یابی با روش سنگر انجام گردید. قطعه حدود 1500 جفت بازي از ژن آلیناز به صورت موفقیتآمیزي با استفاده از آغازگرهاي طراحی شده تکثیر و سپس توالییابی گردید. طول ORF از 1425 نوکلئوتید در گونه A. sativum تا 1449 نوکلئوتید در گونه A. pesoduampeloprasumمتغیر بود. نتایج مربوط به قطعات توالییابی شده در پایگاه دادههاي NCBI GenBank ثبت شدند.
مقدمه
سرده سیر1 از جنس گیاهان گلدار تک لپهاي میباشد که با داشتن صدها گونه از جمله سیر، پیاز، پیازچه، تره فرنگی- بیشتر شناخته شده اند- یکی از بزرگترین گروههاي گیاهان را تشکیل میدهد - 3 - ، بیشتر گونههاي سرده سیر در آب و هواي معتدل نیمکره شمالی زمین رشد میکنند، از میان گونههاي سرده سیر که براي ایران گزارش شده است حدود 28 گونه انحصاري ایران است . - 4 - سیر گیاهی است که مقوي سیستم ایمنی بوده و مصرف آن در بعضی از سرطانها مفید بوده است.
سیر، داراي اثراتی همچون معرق، خلط آور، ضد اسپاسم، ضد ویروس، ضد عفونی کننده، پایین آورنده فشار خون، ضد مالاریا، اشتها آور، صفرا آور است . - ترکیبات گوگردي موجود در سیر، از اسید آمینهاي به نام آلیین، حاصل میگردد. آلیین یک نرکیب ارگانوسولفوره میباشد که سوبستراي آنزیم آلیناز است که از نظر مکانی از هم جدا هستند.
آلیین در سیتوسول و آلیناز در واکوئل تجمع پیدا کردهاند و زمانی که در اثر واکنش فیزیکی مانند له شدن یا خورد شدن بافت، آلیین در معرض آنزیم آلیناز قرار بگیرد به آلیسین، پیروات و آمونیوم تبدیل میگردد. لذا قبل از این واکنش آنزیمی، آلیسین که منبع خواص دارویی سیر است، به طور طبیعی در سیر یافت نمیشود. آلیسین مهمترین پیشساز ترکیبات گوگردي است که در روغنهاي تجاري سیر دیده میشود 2 - ، . - 5 نخستین گزارش از پروتئین آلیناز و توالی cDNA در سیر در سال 1992 به وسیله Van Damme و همکاران ارائه شد، پس از آن توالیهاي منشأ گرفته از چندین گونه از بافتهاي ریشه و غده و برگها گزارش شدهاند . - 5 -
گونههاي سرده سیر ایرانی با توجه به اینکه از گونههاي گیاهی ارزشمند بومی کشور هستند و در سطح جهانی نیز اهمیت زیادي در صنایع غذایی و دارویی دارند، از نظر میزان مطالعات انجام شده روي آن در کشور تا حد زیادي مغفول واقع شده است و مطالعات و بررسیهاي انجام شده روي این گونههاي گیاهی در داخل کشور در حد شایسته و مکفی نبوده است. هدف از مطالعه حاضر شناسایی و توالییابی ژن آنزیم آلیناز دخیل در مسیر بیوسنتز آلیسین بهمراه اولین گزارش در مورد برخی گونههاي جنس Allium بومی ایران میباشد.
مواد و روشها
گونههاي جنس Allium جمعآوري شده از نقاط جغرافیایی مختلف ایران براي این مطالعه که از مرکز ملی ذخایر ژنتیکی و زیستی ایران تهیه شدند در جدول 1 آورده شدهاند. نمونه برداري از بافت برگ تمام گونههاي مورد مطالعه انجام گرفت. شناسایی ژن با استفاده از دادههاي حاصل از نتایج پلاتفرمهاي توالی یابی نسل بعدي1و سپس توالی یابی با روش سنگر انجام گردید. توالیهاي EST مربوط به Allium از چندین پروژه RNAseq دانلود شد . - http://www.ncbi.nlm.nih.gov/sra/ - . توالیهاي به دست آمده با استفاده از نرمافزار Codon Code Aligner v . 5.0.1. سرهمبندي شدند و توالی مورد توافق براي ESTها بدست آمد.
ORF براي هر توالی مورد توافق با استفاده از http://www.ncbi.nlm.nih.gov/gorf/gorf.html - ORF finder مشخص شد. با استفاده از کیت RibospinTM Plant شرکت GeneAll مطابق دستورالعمل سازنده، RNA استخراج گردید، کمیت و کیفیت آن با استفاده نانودراپ - Bio-Rad Co. - و ژل آگارز 1% تعیین گردید. بعد از اعمال تیمار DNase I به مدت 30 min در دماي37 C̊، با استفاده از 1 µg از RNA با کمک کیت شرکت Thermo بر اساس دستورالعمل سازنده اقدام به تهیه cDNA شد.
آغازگرها با استفاده از نرمافزار OLIGO 7 طراحی گردیدند و جهت PCR آشیانهاي1به صورت دو به دو به کار گرفته شدند که در مجموع چهار قطعه را تکثیر میکردند - جدول . - 2 واکنش PCR در سه تکرار و قطعات تکثیري در ژل آگارز %1 بررسی شدند و نهایتاٌ قطعه داراي طول بزرگتر که قطعات کوچکتر را نیز پوشش میداد، جهت توالی یابی توسط شرکت Macrogen انتخاب گردید.
نتایج و بحث
قطعه حدود 1500 جفت بازي از ژن آلیناز به صورت موفقیتآمیزي با استفاده از آغازگرهاي طراحی شده تکثیر و سپس توالی یابی گردید. توالی قطعات توالییابی شده در پایگاه دادههاي NCBI GenBank ثبت شدند. - جدول . - 3 طول ORF براي توالی ژنی از 1425 نوکلئوتید در گونه A. sativum تا 1449 نوکلئوتید در گونه A. pesoduampeloprasum متغیر بود. محتوي G+C براي گونهها در دامنه - A. fistolosum - %44/1 تا - A. mpeloprasum - %43/1 بود.
توالی امینواسیدي براي همه گونههاي جنس Allium در مقایسه با گونه شاهد A. sativum مقایسه گردید که نتایج نشان داد همولوژي بین ژن آلیناز در A. pesoduampeloprasum برابر %94، A. ascalonicum برابر %89، A. fistolosum برابر%89، A. rubellum برابر %87، A. lenkoranikum برابر %86، A. umbilicatum و A. tuberosum برابر %83 و براي A. macrostemon برابر %60 بود. آثار درمانی سیر به واسطه فعالیت آنزیم آلیناز حاصل میشود، لذا جهت مطالعات و دسترسی به اهداف کاربردي در رابطه با خواص دارویی و درمانی آن، شناسایی و مطالعه بر روي ژن آلیناز و ویژگیهاي آن ضروري است. همچنین مطالعه تاثیر تیمارهاي شیمیایی و فیزیکی مختلف بر روي تغییرات بیان این ژن، میتوان جهت شناخت ابعاد مختلف کارکرد و بیان ژن آلیناز راهگشا باشد.
