بخشی از مقاله
چکیده
ژن فاکتور موثر بر رشد و تمایز - GDF9 - از گروه ژن هایی است که براي رشد و تمایز فولیکول هاي اولیه تخمدانی ضروري است. یکی از جهش هاي مهم در جایگاه ژنی GDF9 که با نرخ باروري در گوسفند مرتبط است یک جا به جایی تک نوکلئوتیدي - SNP - است که به FecGH معروف می باشد. این پژوهش به منظور شناسایی جهش FecGH در گوسفند نژاد زل انجام گرفت. از تعداد 150 راس گوسفند زل نمونه خون تهیه و استخراج DNA به روش نمکی بهینه یافته انجام شد.
با استفاده از یک جفت پرایمر اختصاصی یک قطعه 139 جفت بازي از ناحیه اگزون دو ژن GDF9 توسط واکنش زنجیره اي پلی مراز - PCR - تکثیر و محصول روي ژل آگارز 2 درصد آزمون شد. جهت تعیین ژنوتیپ ابتدا از تکنیک PCR-RFLP به منظور شناسایی اختصاصی جایگاه مورد نظر و سپس جهت بررسی گسترده تر از تکنیک PCR-SSCP استفاده شد.
نتایج این پژوهش عدم وجود چند شکلی در این جایگاه ژنی را نشان داده و تمام نمونه ها در این جایگاه داراي ژنوتیپ هموزیگوت وحشی - AA - بودند. با توجه به ثبت رکوردهاي فنوتیپی دو یا چند قلوزایی در این نژاد می توان چنین نتیجه گیري نمود که عامل ژنتیکی مسئول دو یا چند قلوزایی در این نژاد مرتبط به جهش هاي گزارش شده در جایگاه ژنی FecGH نبوده و باید ژنهاي بزرگ اثر دیگري را در این نژاد جستجو نمود.
مقدمه
فاکتور موثر بر رشد و تمایز 9، پروتینی است که در پستانداران به وسیله ژن GDF91 کد می شود 5 - ، - 17 و در گوسفند روي کروموزوم شماره 5 قرار دارد . - 20 - طول این ژن به اندازه 2/5 کیلو جفت باز است که شامل دو اگزون و یک اینترون میباشد.
اندازه اگزون یک 397 جفت باز، اگزون دو 965 جفت باز و اینترون آن شامل 1126 جفت باز میباشد GDF9 . - 8 - عضوي از خانواده بزرگ فاکتور رشد تغییر یافته بتا 2 بوده - 5 - که در رشد وتوسعه فولیکول هاي اولیه در تخمدان - 9 - ، سلول هاي گرانولوزا و تکا، نرخ تخمک ریزي 10 - ، - 17، توقف فعالیت تخمدان نارس - 12 - و همچنین در تمایز و بلوغ اووسیت ها نقش مهمی به عهده دارد 7 - ،. - 20 نشان داده شد که خاموش کردن ژن GDF9 منجر به توقف رشد فولیکول ها در مرحله فولیکول اولیه در موش می شود . - 4 - در همین راستا، هان راهان و همکاران در سال 2004 طی پژوهشی گزارش کردند که این ژن براي تولید و رشد فولیکول در گوسفند نیز ضروري است
بنابراین این ژن می تواند نقش مهم و برجسته اي در باروري داشته و به عنوان یک ژن کاندیداي بزرگ اثر مورد بررسی قرار گیرد. تاکنون پژوهش هاي فراوانی در ارتباط با این جایگاه ژنی میان نژاد هاي مختلف ایرانی انجام شده است.این پژوهش ها اغلب با استفاده از تکنیک PCR-RFLP انجام شده که این تکنیک فقط جهشهایی را در ژن که محل برش آنزیم است شناسایی میکند.
از آنجایی که این احتمال وجود دارد که جهش هاي تک نوکلوتیدي دیگري در طول این ژن وجود داشته باشد بر آن شدیم تا شناسایی چند شکلیهاي احتمالی موجود در این جایگاه ژنی در نژاد زل را علاوه بر تکنیک اختصاصی PCR-RFLP با تکنیک PCR-SSCP نیز مورد آزمون قرار دهیم تا ازاین طریق تمام طول ژن در نژاد زل با دقت بیشتري مورد بررسی قرار گیرد.
مواد و روش ها
براي انجام این پژوهش از 150 راس از گوسفندان نژاد زل مازندران نمونه خون تهیه شد. خون گیري با استفاده از لوله هاي حاوي 1 - EDTAمیلی گرم بر میلی لیتر - و استخراج DNA از 1/5 میلی لیتر خون با استفاده از روش نمکی بهینه یافته انجام شد . - 18 - یک قطعه 139 جفت بازي از اگزون دو ژن GDF9 جهت تکثیر با استفاده از یک جفت آغازگر اختصاصی انتخاب شد . - 8 - صحت تکثیر محصولات PCR توسط ژل آگارز 2 درصد و رنگ آمیزي اتیدیوم بروماید و با استفاده از دستگاه ثبت ژل - بایو رد - 1 رویت سازي و آزمون شد.
در آزمون اول، محصولات PCR تحت تیمار آنزیمی DdeI - شرکت سینا ژن - در دماي 37 درجه سانتی گراد و به مدت 12 ساعت قرار گرفت. سپس محصولات هضم شده روي ژل آگارز 3/5 درصد الکتروفورز و بعد از رنگ آمیزي توسط اتیدیوم بروماید، تعیین ژنوتیب شد.
در آزمون دوم، جهت شناسایی جهش هاي احتمالی، از آنالیز SSCP استفاده شد. نمونهها روي ژل پلی اکریل آمید 14 درصد در دماي 4 درجه سانتی گراد به مدت 16 ساعت الکتروفورز شدند. تعیین ژنوتیپ هر یک از نمونه ها با رویت مستقیم باندها از روي ژل پلی اکریل آمیدي که با استفاده از نیترات نقره رنگ آمیزي شده بود انجام گرفت.
نتایج و بحث
در تحقیق حاضر جایگاه ژنی FecGH از ژن GDF9 به عنوان یک ژن کاندیدا در افزایش چند قلو زایی و باروري در 150 راس از گوسفندان نژاد زل با استفاده از آغازگرهاي اختصاصی تکثیر و سپس با استفاده از تکنیک هاي PCR-RFLP و PCR-SSCP مورد بررسی قرار گرفت.
آنالیز RFLP
در صورت وقوع جهش در این جایگاه - اگزون 2 ژن - GDF9، پس از هضم آنزیمی، آنزیم DdeI قادر به شناسایی جایگاه برشی نبوده اما در صورت عدم وقوع جهش، آنزیم با شناسایی یک محل برش، قطعه تکثیر شده را به دو قطعه 31 و 108 جفت بازي برش خواهد داد. نتیجه این آزمون در نگاره 1 نشان داد. نتایج آزمون RFLP این جایگاه ژنی عدم وجود چندشکلی را نشان داده و همه نمونه ها الگوي باندي مشابه - ژنوتیپ وحشی - AA داشتند.
نگاره .1 نتیجه DdeI:PCR-RFLP ژن - FecGH - GDF9 در گوسفند زل مازندران
آنالیز SSCP
جهت شناسایی جهش هاي احتمالی در دیگر موقعیت هاي قطعه تکثیري از آنالیز SSCP استفاده شد. نتیجه این آنالیز که در نگاره 2 آورده شد نیز الگوي باندي مشابهی - ژنوتیپ وحشی - AA را براي نمونه هاي مورد بررسی نشان داد.
نگاره . 2 نتیجه آزمون PCR-SSCP قطعه 139 جفت بازي از اگزون 2 ژن GDF9 در نژاد زل مازندران
لی و همکاران - 2003 - در تحقیقی که روي نژاد هاي مختلف گوسفند از جمله هو، دورست و سافولک انجام دادند عدم وقوع جهش در این جایگاه ژنی را گزارش کردند . - 14 - چو و همکاران - 2005 - احتمال ارتباط باروري بالا و افزایش نرخ چند قلوزایی در گوسفندان دم کوتاه هان با جهش G8 از ژن GDF9 را رد کردند . - 1 - اکبرپور و همکاران - 2009 - نشان دادند که در جایگاه ژنی FecGHدر نژاد قزل جهش وجود نداشته و نرخ باروري بالاي این نژاد با این جایگاه در ارتباط نیست
قادري و همکاران - 2010 - در پژوهشی که روي گوسفندان نژاد کردي و عربی با استفاده از تکنیک PCR-RFLP انجام دادند الگوي باندي مشابهی را در نمونههاي مورد بررسی گزارش کرده - 6 - و مانند پژوهش هاي فوق نتایجی مشابه با پژوهش حاضر به دست آوردند. با توجه به ثبت رکوردهاي فنوتیپی از گله هاي گوسفند نژاد زل تحت نظارت جهاد کشاورزي استان مازندران، نتایج حاصل از این پژوهش با گزارشات لیائو و همکاران - 13 - ، هانراهان و همکاران - 8 - ، جونگل و همکاران 10 - ، - 11 و دیویس و همکاران 2 - ، - 3 که نشان دادند حالت هموزیگوت منجر به عقیمی و ناباروري میشود، مغایرت دارد.
ادامه پژوهش به منظور فهم هر چه بیشتر ارتباط بین ژنوتیپ و فنوتیپ در حیوانات نازا و مقایسه آن با حیواناتی که باروري طبیعی دارند می تواند احتمالا درك ما در خصوص فرآیند هایی که منجر به رشد و توسعه فولیکول و اووسیت در نژاد هاي بومی را عمیق تر نماید. از طرفی به دلیل پایین بودن توارث پذیري نرخ بره گیري در گوسفند، ظهور این صفت تنها در جنس ماده و نیز عدم بروز آن در اوایل زندگی حیوان، دست یابی به نشانگرهاي ژنتیکی کارآمد می تواند به عنوان یک ابزار مناسب در برنامه هاي اصلاح نژاد گوسفند مورد استفاده قرار گیرد.
