بخشی از مقاله
چکیده
گاما آمینو بوتیریک اسید - گابا - اسید آمینه چهار کربنی غیرپروتئینی موجود در دستگاه عصبی مهرهداران بوده که توسط آنزیم گلوتامیک اسید دکربوکسیلاز تولید میشود. این آنزیم در باکتريهاي اسید لاکتیک فعالیت بالایی دارد. گابا به طور طبیعی در برخی مواد غذایی وجود دارد و به طور شیمیایی ترکیب اصلی در داروهاي ضد افسردگی میباشد، اما به علت برخی عوارض گاباي تولید شده با روشهاي شیمیایی، به تولید بیولوژیکی گابا روي آورده شده است. در این مطالعه، تلقیح باکتري لاکتوباسیلوس برویس در pH حدود 6 انجام گرفت. عمل انکوباسیون به مدت 120 ساعت در دماي 30 درجه سانتیگراد صورت پذیرفت.
بعد از انجام عمل تخمیر به منظور بررسی گاباي تولید شده در خارج سلول، محلول رویی عصاره سانتریفیوژ شده 10000 - دور در دقیقه در دماي 4 درجه سانتیگراد به مدت 10 دقیقه - و از سوپرناتانت آن براي تشخیص گاباي تولید شده استفاده شد. جهت شناسایی گابا تولید شده توسط لاکتوباسیلوس برویس از روش کروماتوگرافی لایه نازك و بستر سیلیکاژل به عنوان فاز ثابت و از حلال مخصوص گابا - استیک اسید، بوتانول و آب مقطر - استفاده گردید. پس از انجام آزمون و آشکارسازي به وسیله معرف نینهیدرین باند نمونه روبروي باند گاباي خالص تشکیل شد و در نهایت امکان تولید گابا مورد تایید قرار گرفت.
مقدمه
گاما آمینو بوتیریک اسید - گابا - C4H9NO2 اسید آمینه چهار کربنی غیر پروتئینی موجود در دستگاه عصبی مهرهداران بوده که در انسان به طور طبیعی توسط آنزیم گلوتامیک اسید دکربوکسیلاز Glutamic Acid Decarboxylase - GAD - تولید میشود.گابا بعد از تولید به گیرندههاي خود - آلفا، بتا و گاما - که در غشاي پس سیناپسی سلول هاي عصبی قرار گرفتهاند منتقل شده و از یک سري پیامهاي مربوط به بیماريهاي سیستم عصبی و خود ایمنی مانند مالتیپل اسکلروسیس - MS - ، پارکینسون، شیزوفرنی، سرطان، آلزایمر و ... جلوگیري میکند.
همچنین با افزایش اکسیژن رسانی به بافت فشار خون را تنظیم کرده و به فرد احساس آرامش میدهد علاوه بر آن خواص ضد افسردگی، ضد دیابت و آنتی اکسیدانی نیز دارد. در برخی مواقع به دلیل کمبود هورمون استروژن و یا کمبود روي و همچنین با افزایش افزودنیهاي غذایی و تجمع سالیسیلیک اسید در بدن میزان تولید گابا کم شده و در نتیجه وجود این ترکیب در رژیم غذایی ضرورت پیدا میکند.
گابا به طور طبیعی در برخی مواد غذایی مثل سبزیجات، سیبزمینی، برخی غلات و لبنیات وجود دارد و به طور شیمیایی ترکیب اصلی در داروهاي ضد افسردگی میباشد ولی به علت خطرات ناشی از کمبود این اسید آمینه - ناراحتی هاي روحی و بیماري هاي عصبی - و همچنین برخی عوارض گاباي شیمیایی به تولید بیولوژیکی گابا روي آورده شده است - طاهرزاده و همکاران، . - Li et al., 2010 ;1393
گابا طی عمل دکربوکسیلاسون از گلوتامیک اسید تولید میشود. در ابتدا براي تولید گابا از باکتري اشرشیا کلی به علت دارا بودن آنزیم GAD استفاده میشد ولی به خاطر وجود خطرات ایجاد توکسین و بیماريزایی، استفاده از آن محدود شد و باکتريهاي لاکتیک اسید به علت دارا بودن این آنزیم و همچنین ایمن بودن و مهار باکتريهاي بیماري زا به عنوان جایگزین انتخاب شدند.
باکتري هاي لاکتیک اسید گرم مثبت، بدون اسپور، میلهاي و تخمیر کننده هستند و توانایی تحمل اکسیژن و شرایط اسیدي را دارند. این باکتري ها براي زنده مانی و انجام عمل تخمیر به مواد مغذي، کربوهیدرات، اسید چرب و اسید آمینه و پپتید ها نیاز دارند. به علت قرار گیري آنزیم GAD در سیتوپلاسم سلول باکتري، گابا ابتدا داخل سیتوپلاسم ساخته و سپس به بیرون سلول وارد میشود بنابراین هم به شکل خارج سلولی و هم داخل سلولی تولید میشود ولی چون غلظت گاباي خارج سلولی بیشتر است این نوع را در نظر میگیریم. pH بهینه فعالیت آنزیم GAD بین 4 تا 5/5 بوده و دماي بهینه 30 تا 50 درجه سانتیگراد میباشد - Diana et al.,
در بررسیهاي صورت گرفته روي خانوادهي باکتريهاي اسید لاکتیک لاکتوباسیل هاي پلانتاروم، برویس، پاراکازئی و ساکی به عنوان گونههاي تولیدکننده گابا معرفی شدند. از میان آنها گونه لاکتوباسیلوس برویس در محیط حاوي گلوتامیک اسید و منبع کربن بیشترین بازده تولید گابا را دارد - طاهرزاده و همکاران، . - Li et al., 2010 ;1393 در میان روشهاي شناسایی اسیدهاي آمینه، روش کروماتوگرافی لایه نازك با عملکرد بالا توانایی و کاربرد گستردهاي دارد زیرا روشی حساس و به نسبت ساده براي شناسایی و تعیین مقدار بیشتر مواد حتی با مقادیر کم است.
همچنین در این روش، آنالیز در زمان کوتاهی انجام پذیر است و با کاربرد و نگهداري مناسب از آن، میتوان نتایجی با دقت و صحت خوب به دست آورد. در این روش از یک لایه نازك و یکنواخت سیلیکاژل یا آلومینا که روي یک قطعه شیشه اي، فلزي یا پلاستیک سخت، پوشش داده شدهاند، به عنوان فاز ثابت استفاده میشود براي فاز متحرك نیز از یک حلال مایع مناسب یا ترکیبی از حلالها استفاده شده و نمونه در آن حل شده و پس از عبور از فاز ساکن تشکیل باند میدهد. سپس با استفاده از شناساگر مناسب باندها نمایان میشوند - Zandy et al., هدف از این پژوهش، شناسایی گاما آمینو بوتیریک اسید - گابا - تولید شده توسط باکتري لاکتوباسیلوس برویس با استفاده از روش کروماتوگرافی لایه نازك بود.
مواد و روشها
در این مطالعه به منظور آماده سازي محیط کشت عمل استریلیزاسیون در دماي 121درجه سانتیگراد به مدت 15دقیقه صورت گرفت. تلقیح باکتري لاکتوباسیلوس برویس در pH حدود 6 انجام گرفته و به مدت 120 ساعت در دماي 30 درجه سانتیگراد گرمخانهگذاري انجام پذیرفت . - Ueno et al., 1997 - بعد از انجام عمل تخمیر به منظور بررسی گاباي تولید شده در خارج سلول، محلول رویی عصاره سانتریفیوژ شده 10000 - دور در دقیقه در دماي 4 درجه سانتیگراد به مدت 10 دقیقه - و از سوپرناتانت آن براي تشخیص گاباي تولید شده استفاده شد - Ueno. - et al., 1997
در مرحله بعد به منظور شناسایی گابا به روش کروماتوگرافی لایه نازك - شماتیک کروماتوگرافی لایه نازك در شکل 1، نشان داده شده است - از بستر سیلیکاژل به عنوان فاز ثابت و از حلال مخصوص گابا - استیک اسید، بوتانول، آب مقطر - استفاده شد. بعد از آماده سازي نمونه حجم مشخصی از نمونه روي صفحه قرار داده سپس صفحه داخل تانک دستگاه که حاوي حلال مخصوص میباشد، قرار داده شد. هنگامی که سطح حلال روي صفحه به ارتفاع مشخص رسید صفحه را خارج کرده و با کمک نور UV و یا محلول ناینهیدرین آشکار سازي با توجه به نمونه شاهد به طور کیفی انجام گرفت.
نتایج و بحث
در این مطالعه افزودن نمک معدنی به محیط کشت جهت تولید گابا توسط گونه لاکتوباسیلوس برویس مورد استفاده قرار گرفت، و احتمال تولید این اسید آمینه به روش کروماتوگرافی لایه نازك بررسی شد. پس از انجام آزمون و آشکارسازي به وسیله معرف نینهیدرین باند نمونه روبروي باند گاباي خالص تشکیل شد و در نهایت امکان تولید گابا مورد تایید قرار گرفت.
