بخشی از مقاله
چکیده - در این پژوهش، به منظور آشکارسازیتابش فلورسانسِ مولکولهای فامساز برچسبگذاریشده در نمونه، یک میکروسکوپ فلورسانسیِبازتابِ داخلیِ کلی بر پایه موجبر نوری طراحی و راهاندازی شده است. در میکروسکوپفلورسانسِی بازتابِ داخلیِ کلی از پدیده بازتابش داخلی کلی بهره گرفته میشود. درواقع، هنگامیکه بازتابش داخلی کلی رخ میدهد، یک موج میرا در محیط رقیقتر انتشار مییابد و این موج میرا برای نوردهی نمونه استفاده میشود.
درنهایت امکان مشاهده بخش سطحی نمونه - به جای عمق - که با مولکولهای فامساز نشاندار شده است، فراهم میشود. بدین منظور، ابتدا با استفاده از ابزارهای اپتیکی و اپتومکانیکی موجود در آزمایشگاه، یک میکروسکوپ وارون طراحی و ساخته شده است. سپس با استفاده از این میکروسکوپ وارون، چیدمان میکروسکوپفلورسانسِ بازتابِ داخلیِ کلی بر پایه موجبر نوری جهت تصویربرداری برپا شده است و از چند نمونه نقطه کوانتومی کادمیم سلنید، تصویربرداری صورت گرفته است.
-1 مقدمه
میکروسکوپیورسانسِفل بازتابِ داخلیِ کلی، روشی اپتیکی است که امکان تصویربرداری لایه نازکی از نمونه را فراهم میکند و در زیستشناسی سلولی برای مشاهده و بررسی غشای سلولی به کار میرود. این روش از بازتابش داخلی کلی میان سطح زیرین نمونه و زیرلایه جهت مشاهده نمونه مورد مطالعه بهره میگیرد. از دیدگاه اپتیک هندسی، هنگامیکه پرتوی نور از محیطی با ضریب شکست بیشتر به محیطی با ضریب شکست کمتر وارد میشود، در یک زاویه تابش خاص، به نام زاویه بحرانی، پرتوی نور شکستهشده، در امتداد فصل مشترک دو محیط انتشار مییابد و به ازای زاویههای تابش بزرگتر از زاویه بحرانی، بازتابش داخلی کلی رخ میدهد.
از دیدگاه اپتیک موجی، هنگامیکه بازتابش داخلی کلی روی میدهد، بخشی از موج الکترومغناطیسی تابشی، که موج میرا نامیده میشود، بهصورت جزئی به محیط با ضریب شکست کمتر نفوذ پیدا میکند؛ از این موج میرا میتوان برای نوردهی قسمتهای خاصی از نمونه که در تماس با سطح زیرلایه قرار دارند، استفاده کرد. مطابق شکل - -1الف - ، در میکروسکوپفلورسانسِی بازتابِ داخلیِ کلی، ابتدا نمونه مورد مطالعه را با مولکولهای فامساز برچسبگذاری میکنند و سپس نمونه تحت زاویهای بزرگتر از زاویه بحرانی پرتودهی میشود.
امواج میرای تولید شده، بهطور گزینشی موجب برانگیخته شدن مولکولهای فامساز نزدیک سطح تماس پوشش شیشهای-سلول میشوند. درنهایت، تابش گسیلشده از مولکولهای فامساز را جمعآوری کرده و امکان مشاهده بخشهای مورد نظر فراهم میشود. شدت موج میرا بهطور نمایی با افزایش فاصله از فصل مشترک دو محیط، کاهش پیدا میکند. ازاینرو، تنها لایه نازکی از نمونه به ضخامت حدود 100-200 نانومتر روشن میشود که امکان بررسی برخی از ویژگیهای سطح نمونه مانند چسبندگی را فراهم میکند.
شکل :1 - الف - نمودار طرحواره پدیفلورسانسِده بازتابِ داخلیِ کلی، - ب - نمودار شدت موج میرا بر حسب فاصله از فصل مشترک. چیدمانهای نوری مختلفی برای میکروسکوپیفلورسانسِ بازتابِ داخلیِ کلی میتوانند به کار روند. در اوایل دهه 1980 میلادی، اکسلرد چیدمانهای آزمایشگاهی میکروسکوپ فلورسانسیِ بازتابِ داخلیِ کلی را برای میکروسکوپهای وارون و مستقیم توصیف کرد 1] و .[2 بهطورکلی برای میکروسکوپ فلورسانسیِبازتابِ داخلیِ کلی تاکنون سه نوع چیدمان مورد بررسی قرار گرفته است: چیدمان بر پایه منشور، بر پایه عدسی شیئی و بر پایه موجبر نوری. هر سه چیدمان ویژگیهای متفاوتی دارند که بسته به کار مورد نظر از آنها استفاده میشود.
درواقع این چیدمانها در روشهای پرتودهی تفاوت دارند؛ در میکروسکوپ فلورسانسیِبازتابِ داخلیِ کلی بر پایه منشور، پرتوی لیزر از طریق یک منشور تحت زاویه فوق بحرانی به فصل مشترک پوشش شیشهای-نمونه هدایت میشود تا امکان پدیده بازتاب داخلی کلی فراهم شود. درحالیکه در میکروسکوپ فلورسانسیِبازتابِ داخلیِ کلی بر پایه عدسی شیئی، پرتوی لیزر قبل از روشن کردن نمونه از یک عدسی شیئی عبور میکند. این عدسی هم برای پرتودهی به فصل مشترک و هم برای مشاهده فلورسانس گسیلی استفاده میشود.
در میکروسکوپ فلورسانسیِبازتابِ داخلیِ کلی بر پایه موجبر نوری، پرتوهای نور توسط تار نوری از منبع نور به داخل موجبر نوری هدایت میشود. موجبر نوری در این چیدمان میتواند یک پوشش شیشهای مستطیلی شکل یا مدور باشد. بعدازاینکه نور وارد موجبر نوری میشود، در سطوح بالا و پایین موجبر بازتاب چندگانه رخ میدهد و ناحیه وسیعی از موج میرا ایجاد میشود.
-2 روش تجربی
از بین سه چیدمانی که در بخش پیش به آن اشاره شد، چیدمان بر پایه منشور بهترین نسبت داده به نوفه را فراهم میکند؛ اما برای مشاهده نمونههای با محفظه باز در میکروسکوپ وارون مناسب نیست. چیدمان بر پایه عدسی شیئی برای مشاهده نمونههای با محفظه باز قابل اجرا است و امکان دسترسی به نمونه وجود دارد ولی برپایی این چیدمان تنها با عدسیهای شیئی با عدد گشودگی بالا - گران - امکانپذیر است .[3]
چیدمان میکروسکوپ فلورسانسیِبازتابِ داخلیِ کلی بر پایه موجبر نوری، انعطافپذیر است و میتواند با عدسیهای شیئی با عدد گشودگی کم و با ماده واسط هوا، آب و یا روغن انجام شود درحالیکه نسبت داده به نوفه خوبی را نیز فراهم میکند و علاوه بر این، برپایی چیدمان آن خیلی هزینهبر نیست. در شکل 2، آرایه آزمایشگاهی میکروسکوپ فلورسانسیِ بازتابِ داخلیِ کلی بر پایه موجبر نوری در میکروسکوپ وارون نشان داده شده است. در این چیدمان، از یک لام ذوزنقهایشکل بهعنوان موجبر نوری استفاده شده است و نمونه مورد مطالعه روی این لام قرار داده میشود.
نور لیزر از طریق تار نوری وارد موجبر نوری میشود . درواقع، برای اینکه در داخل موجبر نوری بازتاب داخلی کلی رخ دهد، لازم است که نور تحت زاویه فوقبحرانی به فصل مشترک لام-نمونه تابیده شود؛ تنظیم زاویه بهوسیله یک قطعه گوهمانند انجام گرفته است. بعدازاینکه نور لیزر تحت زاویه فوقبحرانی به فصل مشترک لام-نمونه تابیده میشود، بازتاب داخلی چندگانه در داخل موجبر رخ میدهد.
سپس ناحیه وسیعی از موج میرا ایجاد شده و موجب برانگیختگی مولکولهای فامساز موجود در نمونه میشود. درنهایت، تابش گسیلشده از نمونه پس از عبور از عدسی شیئی، توسط آینه بازتاب شده و به چشمی میکروسکوپ میرسد. تصویر نمونه از چشمی میکروسکوپ قابل مشاهده است؛ در این چیدمان یک دوربین بار جفتشده جهت تصویربرداری به چشمی میکروسکوپ وصل شده است.
1؛-2 راهاندازی و تصویربرداری
در میکروسکوپیفلورسانسِ بازتابِ داخلیِ کلی تنها از پایینترین سطح نمونه که در تماس با زیرلایه است، تصویربرداری میشود؛ بنابراین ابتدا کانونی کردن عدسی شیئی روی سطح لام انجام گرفته است. بعد از کانونی کردن عدسی شیئی روی سطح لام، لازم است نمونه جهت تصویربرداری آماده شود. از این چیدمان برای تصویربرداری از دو نمونه نقطههای کوانتومی کادمیم سلنید استفاده شده است.
نمونه اول شامل محلول نقطههای کوانتومی کادمیم سلنید بر انگیخته با طولموج سبز در محلول رودامین است؛ جهت آمادهسازی نمونه، مقداری از محلول حاوی نقطههای کوانتومی کادمیم سلنید که با طولموج سبز برانگیخته میشوند، در محلول رودامین و اتانول ریخته شده است. سپس چند قطره از نمونه شامل این نقطههای کوانتومی و محلول رودامین، روی لام ذوزنقهای قرار دادهشده و با هدایت نور تکفام لیزر به داخل موجبر نوری، تصویربرداری از نقطههای کوانتومی موجود در محلول رودامین صورت گرفته است.
در این مرحله از لیزر نئودمیوم-یاگ با طولموج 532 نانومتر و توان اسمی 100 میلی وات استفاده شده است. همچنین برای نقطههای کوانتومی کادمیم سلنید که با طولموج فرابنفش برانگیخته میشوند، آزمایش تکرار شده است و از نقطههای کوانتومی برانگیخته با نور فرابنفش و محلول رودامین تصویربرداری انجام شده است. در این مرحله، لیزر دیود فرابنفش با طولموج 405 نانومتر و توان 20 میلیوات به کار رفته است. تصویرهای ثبتشده در شکلهای 3 و 4 آورده شده است.
