بخشی از مقاله
چکیده:
در جوامع امروزي بیماري مالاریا با مقاوم شدن انگل بیماري نسبت به داروهاي از قبل موجود کماکان بصورت خطري جدي براي سلامت بشر مطرح میباشد. کاهش درصد این بیماري مستلزم طراحی و ساخت داروهاي جدید بر علیه انگل این بیماري میباشد. آنزیم هاي راه سنتز بازهاي پیریمیدین از مسیر de novo هدف مناسبی براي ساخت و تولید داروهاي جدید براي مبارزه با این بیماري میباشند.
یکی از آنزیمهاي پیشبرنده واکنشهاي سنتز این بازها در پلاسمودیوم فالسیپاروم، آنزیم اوروتیدین 5 منوفسفات دکربوکسیلاز میباشد که فعالیت آن پس از بیان و انبوه سازي در گونه اي از باکتري اشریشیا، در حضور ترکیب سنتز شده آلوپورینول ریبوزید -5 منوفسفات اندازه گیري گردید. اتصال محکم این ترکیب به آنزیم - Ki = 0.24 μM - نشان میدهد بازدارندگی از نوع رقابتی بوده، قدرت چسبندگی آن در مقایسه با آنزیم مشابه در انسان - Ki = 0.8 μM - بیشتر میباشد.
مقدمه:
علی رغم بیش از یک قرن تلاش جهت مبارزه با مالاریا، این بیماري کماکان بصورت جدي سلامت بشر را تهدید میکند. مالاریا توسط چهار گونه از انگل گونه پلاسمودیوم ایجاد میگردد که از بین این چهار گونه، پلاسمودیوم فالسیپاروم مسئول بخش اعظمی از بیماري با آمار 237 میلیون مورد مبتلا و 2-3 میلیون مرگ و میر در سال میباشد . - 1 - وجود تفاوت هائی مابین راههاي متابولیسمی در سلول میزبان و انگل، مسیر هائی را جهت پیشرفت در زمینه تولید داروهائی بر علیه این انگل نشان میدهد.
یکی از این موارد شناسائی آنزیم و یا راه متابولیکی است که وجود آن در انگل جهت ادامه حیات ضروري است ولی در سلول میزبان حیاتی بنظر نمیرسد. فعالیت این آنزیم یا مسیر پس از شناسائی توسط بازدارنده ها متوقف میگردد. آنزیم هاي راه سنتز بازهاي پیریمیدین از مسیر de novo از آنجائی که سلول هاي میزبان قادر به سنتز این بازها از مسیر salvage نیز میباشند هدف مناسبی براي این کاربنظر میرسند.
آنزیم اوروتیدین 5 منوفسفات دکربوکسیلاز - ODCase - ششمین مرحله از واکنشهاي مربوط به راه سنتز بازهاي پیریمیدین از مسیر de novo را که تبدیل اوروتیدین -5 منوفسفات به یوریدین -5 منوفسفات است را کاتالیز میکند. این آنزیم هدف مناسبی جهت تولید داروهاي ضد مالاریا بر علیه انگل این بیماري که نسبت به داروهاي از قبل موجود مقاوم شده اند میباشد.
مواد و روشها:
- فسفوریلاسیون آلوپورینول ریبوزید: آلوپورینول ریبوزید Allopurinol riboside با تغییر روش - 7 - Fyfe et al در مکان 5' خود در حضور آلوپورینول - 20mM - ، نیترو فنیل فسفات - 250mM - ، فسفوترانسفراز - 0.5mg - و استات سدیم - 300mM, pH 5.0 - فسفوریله گردید. ترکیبات فوق پس از مخلوط شدن بمدت 7 روز در دماي 37 درجه سانتیگراد قرار گرفتند.
در روز هفتم واکنش با اضافه نمودن محلول سرد پرکلریک اسید - 0.2M - متوقف شد. نمونه چندین بار بصورت متوالی vortex شده روي یخ قرار گرفتند. سپس بمدت 10 دقیقه در دور 10000g در دماي 4 درجه سانتیکراد سانتریفوژ شدند. محلول روئی پس از خنثی شدن با محلول خنثی کننده chloroform/tri- - - n-octylamine هوخورده، در شرایطی مشابه با قبل سانتریفوژ شدند. فاز روئی که حاوي آلوپورینول ریبوزید -5 منوفسفات میباشد جدا و براي خالص سازي بعدي در یخچال نگهداري گردید.
- خالص سازي آلوپورینول ریبوزید -5 منوفسفات آلوپورینول ریبوزید -5 منوفسفات با استفاده از دستگاه HPLC تا حد بالائی خالص گردید. در این روش با استفاده از ستون کروماتوگرافی جذبی Partisil 10-SAX با ضخامت 10 میکرون - کمپانی Phenomenex استرالیا - تخلیص در دماي 25 درجه سانتیگراد انجام پذیرفت. بدین منظور ستون در ابتدا تحت تاثیر محلولی شامل فرمیک اسید 0/08 درصد، متانل 35 درصد قرار گرفته، پس از قرار دادن نمونه، ستون با نمک فورمات آمونیوم 0-1 - مولار - با PH 3.0 با سرعت 1 ml/min شستشو داده شد.
نمونه هائی که حداکثر جذب در طول موج 251 نانومتر را در حین خروج از ستون داشتند در لوله هائی جدا جمع آوري و در محیط خلاء توسط دستگاه Lyophilizer خشک شدند. پودر بدست آمده در حجم کم آب دو بار تقطیر حل و نمونه ها در دماي -20 درجه سانتیگراد جهت استفاده بعدي نگهداري شدند. غلظت آلوپورینول ریبوزید -5 منوفسفات حاصله توسط اسپکتروفتومتر با استفاده از داده هاي مربوط به آلوپورینول - λmax = 251 nm, ε = 8350 M-1cm-1 - تعیین گردید.
- الگوي بازدارندگی آلوپورینول ریبوزید -5 منوفسفات براي آنزیم اوروتیدین 5 منوفسفات دکربوکسیلاز انگل مالاریا سرعت اولیه واکنش براي اوروتیدین 5 منوفسفات دکربوکسیلاز در حضور غلظت ثابت از ماده اولیه تعیین گردید. بدین منظور در حضور بافر MOPS با pH 7.2 ، نمک NaCl با غلظت 150 میلی مولار، گلیسرول با غلظت 5 درصد، سوبسترا - [OMP]= 0.5µM - و آلوپورینول ریبوزید -5 منوفسفات - - I=[0.004-0.4] واکنش انجام و نمونه ها پس از زمان مشخص بر روي کاغذهاي کرواتوگرافی PEI-C لکه گذاري شدند. لکه ها پس از خشک شدن در مقابل صفحه حساس عکاسی قرار گرفته، میزان تولید فراورده با دستگاه Typhoon 8600 اندازه گیري گردید.
نتایج و بحث:
آنالیز سینتیک واکنشی که توسط آنزیم اوروتیدین 5 منوفسفات دکربوکسیلاز در انگل مالاریا کاتالیز میشود از قانون میکائیلیس_ منتن پیروي میکند. شناسائی بازدارنده هاي فعالیت این آنزیم کمک به درمان این بیماري در عصر جدید مینماید. آلوپورینول ریبوزید -5 منوفسفات با روشی که در بخش مواد و روشها اشاره شد توسط سیستم HPLC خالص گردید.
غلظت آلوپورینول ریبوزید -5 منوفسفات بدست آمده 9/8 میلی مولار محاسبه گردید. شکل 1 نمودار جداسازي ترکیبات مختلف را توسط سیستم HPLC نشان میدهد. جهت محاسبه ثابت بازدارندگی - Ki - آلوپورینول ریبوزید -5 منوفسفات آنزیم اوروتیدین 5 منوفسفات دکربوکسیلاز انگل مالاریا، غلظتهاي مختلف از بازدارنده در حضور غلظت ثابتی از سوبسترا بکار گرفته شد. نمودار Dixon plot مربوط به داده ها در شکل شماره 2 آمده است. مقدارKi = 0/199 ± 0/034 از روي نمودار محاسبه گردید.
