بخشی از مقاله
چکیده:
در فرایند تراریختی گیاه از ژنهاي نشانگري همچون مقاومت به آنتی بیوتیک ها و علف کش ها جهت تشخیص ریزنمونه هاي تراریخت استفاده می گردد. به دلیل نگرانی هاي زیست محیطی، حذف نشانگرهاي آنتی بیوتیکی از ناقلین و گیاهان تراریخت مورد توجه قرار گرفته است. در اینجا سعی شده از ژن EPSPS جهش یافته باکتریایی متحمل به گلایفوسیت به عنوان یک نشانگر انتخابی جهت جداسازي سلول هاي گیاهی تراریخت در حضور علف کش گلایفوسیت Roundup® استفاده شود.
در این پروژه جهت طراحی یک ناقل با بکارگیري روش هاي ملکولی، ابتدا ژن EPSPS جهش یافته به یک اینترون، پروموتر قوي و دائمی و یک خاتمه دهنده گیاهی متصل شده و سپس قطعه حاصل به عنوان ژن نشانگر وارد یک ناقل بیانی گیاهی می گردد. این ناقل به منظور انتقال به آگروباکتریوم و سپس به داخل سلول هاي گیاهی در طی فرایند تراریزش مورد استفاده قرار خواهد گرفت. سپس سلول هاي تراریخت در محیط حاوي گلایفوسیت انتخاب می شوند. به عبارتی در اینجا کارآیی ژن EPSPS جهش یافته در انتخاب سلول هاي گیاهی تراریخت در طی فرایند تراریزش و نیز سلول هاي گیاهی گزینش شده مورد آنالیز و بررسی قرار می گیرند.
مقدمه:
در فرایندهاي معمولی تراریزش گیاهی به دلیل اینکه غالباً فراوانی افراد تراریخت پائین است ، استفاده از ژنهاي نشانگر نظیر مقاومت به آنتی بیوتیک ها جهت تشخیص سلول هاي تراریخت ضروري می باشد. اگر چه هنوز هیچ مدرك مستدلی پیرامون مشکل زا بودن این ژنها منتشر نشده است، اما نگرانی هاي زیست ایمنی موجب گردیده تا حذف ژنهاي مقاومت به آنتی بیوتیک ها مورد توجه قرار گیرد.
جایگزینی ژنهاي آنتی بیوتیکی با ژنهایی که منشاء گیاهی دارند می تواند به عنوان یک راه حل مناسب مطرح گردد. در این راستا بوجود آوردن ناقلین تراریختی گیاهی که بتوانند دربرابر علف کش هایی با طیف وسیع و در عین حال ایمن از لحاظ زیستی، نظیر گلایفوسیت ایجاد مقاومت نمایند، مورد توجه است. این ناقلین می توانند ضمن بالا بردن عملکرد جداسازي سلول هاي تراریخت، از مصرف آنتی بیوتیکها و پراکنده شدن ژن آنها در طبیعت جلوگیري به عمل آورد.
علاوه بر آن، به کارگیري این ناقلین از بوجود آمدن ترکیباتی که از عملکرد ژنهاي مقاومت به آنتی بیوتیک ها در گیاهان بوجود می آید، جلوگیري می نماید. به عبارت دیگر ایمن بودن محصولات ناشی از گیاهان تراریخت تا حدود زیادي تضمین می گردد. ژن مورد نظر که قادر به ایجاد تحمل در برابر علف کش گلایفوسیت - به عنوان انتخاب گر - است، ژن جهش یافته EPSPS باکتریایی می باشد. این ماده یکی از آنزیم هاي کلیدي چرخه شیکیمات است که در تولید اسیدهاي آمینه حلقوي در گیاهان و پروکاریوت ها عمل می نماید.عدم عملکرد این آنزیم موجب فقر اسیدهاي آمینه ضروري و مرگ سلول گیاهی می شود.
مواد و روشها:
ابتدا طبق روش CTAB استخراج DNA کروموزومی از برگهاي سبز گیاه ذرت انجام گردید. تمامی مراحل کار با دقت و به آرامی صورت گرفت تا DNA ژنومی خرد نشود. در مرحله بعد با استفاده از PCR و پرایمرهاي طراحی شده HsMzF - و - HsMzR و DNA کروموزومی به عنوان الگو با آنزیم Expand که داراي خاصیت ترمیم - Proofreading - بوده و دقت بالایی دارد، انجام گردید. قطعه اینترون hsp70 حاصل با استفاده از آنزیم T4 DNA Ligase در درون ناقل pTZ57R/T - ناقل - T/A کلون شده و تراریزش سلولهاي E.coli DH5α انجام گرفت.
قطعه اینترون hsp70 حاصل از PCR پس از کلون شدن در پلاسمید pTZ57R/T و تا ئید کلونینگ جهت تعیین توالی به شرکت ژن فن آوران فرستاده شد. در مرحله بعد اتصال قطعه اینترون hsp70 به TP+EPSPS توسط روش تکثیر قطعات همپوشان Overlapping Extension و PCR PCR در 3 مرحله انجام گرفت. در دو مرحله اول عمل PCR در 30 سیکل با آنزیم Pfu که داراي خاصیت اصلاح اشتباه - Proofreading - بوده و دقت بالایی دارد، انجام شد.
در مرحله سوم جهت اتصال دو قطعه به هم از پرایمرهاي InTPF و TPInR و آنزیم Expand high fidelity استفاده گردید. قطعه Intron+TP+EPSPS با استفاده از آنزیم T4 DNA Ligase در درون ناقل pTZ57R/T - ناقل - T/A کلون شد. در مرحله بعد جداسازي پروموتر 35sCaMV و خاتمه دهنده NOS و اتصال آنها به ابتدا و انتهاي قطعه Intron+TP+EPSPS نیز با استفاده از PCR و روش تکثیر قطعات همپوشان انجام شد و ساختار کامل نهایی بدست آمد.
در قسمت بعدي کار ژن مقاومت به کانامیسین - nptII - از پلاسمید pBI121 با استفاده از آنزیم هاي محدودکننده PmeI و HindIII حذف شده و اتصال دو انتها به هم - self-ligation - انجام گرفت و پلاسمید pBI121 فاقد nptII بدست آمد. در بخش انتهایی کار، کلونینگ ساختار نهایی مقاومت به گلایفوسیت در ناقل pBI121 فاقد nptII با استفاده از آنزیم EcoRI انجام گرفت.
نتایج و بحث:
از برگ هاي سبز گیاهان ذرت 7 روزه استخراج DNA کروموزومی انجام گرفت و محصول بر روي ژل آگاروز %1 برده شد که نمونه هاي استخراج DNA کروموزومی از کیفیت و غلظت مناسبی برخوردار بودند. سپس PCR جهت جداسازي قطعه اینترون ژن hsp70 ذرت انجام شد و قطعه 780bp حاصل در ناقل pTZ57R/T کلون شد. براي غربالگري از محیط مک کانکی آگار حاوي آمپی سیلین و تفکیک کلونیهاي سفید و آبی استفاده شد.
پس از اطمینان از صحت کلونینگ، نمونه هاي پلاسمیدهاي استخراج شده حاوي قطعه اینترون جهت تعیین توالی فرستاده شدند و صحت آن تائید گردید.در قسمت بعدي کار اتصال دو قطعه اینترون - 780bp - hsp70 و - 1500bp - TP+EPSPS انجام شد و قطعه 2300bp حاصل به عنوان قطعه اصلی در مراحل بعدي مورد استفاده قرار گرفت.
در بخش بعدي پروموتر - 700bp - 35sCaMV و خاتمه دهنده - 300bp - nos با استفاده از PCR جدا شده و توسط روش تکثیر قطعات همپوشان به ابتدا و انتهاي قطعه اضافه شدند تا ساختار نهایی با 3300bp بدست آید که پس از کلونینگ در pTZ57R/T تعیین توالی گردید تا صحت آن تایید شود. در قسمت بعدي کار ژن مقاومت به کانامیسین - nptII - از پلاسمید pBI121 با استفاده از آنزیم هاي محدودکننده PmeI و HindIII حذف شده و پس از پر کردن انتهاي چسبنده حاصل با آنزیم Klenow، اتصال دو انتها به هم - self-ligation - انجام گرفت و پلاسمید pBI121 فاقد nptII بدست آمد. در بخش انتهایی کار کلونینگ قطعه 2300bp در پلاسمید pBI121 فاقد nptII با آنزیم EcoRI انجام گرفت و غربالگري با روش کلونی PCR صحت کار را تائید کرد.
در اینجا ژن مقاومی به گلایفوسیت که بعنوان ژن نشانگر عمل می کند در سمت نزدیک به LB قرار می گیرد و ژن GUS در سمت نزدیک به RB و از آنجایی که در هنگام انتقال ژن از پلاسمید به درون ژنوم گیاه، تکثیر از سمت RB آغاز شده و تا LB ادامه می یابد، اگر عمل تکثیر به صورت ناقص انجام شود و فقط ژن GUS انتقال یابد، چون ژن مقاومت به گلایفوسیت - selectable marker - وارد گیاه نشده پس گیاه به گلایفوسیت مقاوم نمی شود و در طی مراحل غربالگري در حضور گلایفوسیت از بین می رود و در نتیجه فقط گیاهان تراریختی انتخاب می شوند که ژن مقاومت به گلایفوسیت و بالطبع ژن GUS را دریافت کرده اند.
