بخشی از مقاله
چکیده
آنزیم بتا گلوکوزیداز - EC 3.2. 1.21 - هیدرولیز باندهاي بتا-دي-گلوکوزیدي را کاتالیز میکند.در این تحقیق بتاگلوکوزیداز قارچ آسپرژیلوس نایجر در میزبان پیکیا پاستوریس بیان گردید. ژن بتا گلوکوزیداز با در نظر گرفتن کاربرد کدون ها در مخمر پیکیا پاستوریس سنتز شد. براي بیان آنزیم بتا گلوکوزیداز در پیکیا پاستوریس از وکتور pPink- HC که حاوي پروموتورالقایی AOX1 و ژن مقاومت به آمپی سیلین و ژن سازنده ي آدنین بود استفاده شد.
وکتورهاي بیانی نوترکیب توسط آنزیم BspTI خطی شدند. توسط روش الکترو پوریشن سلول هاي یپیکیا پاستوریس ترنسفورم شدند وبا استفاده از محیط انتخابی مخمرهاي ترنسفورم شده جدا گشتند. بیان خارج سلولی آنزیم بتاگلوکوزیداز توسط SDS-PAGE وسنجش میزان فعالیت آنزیم تایید شد.در مرحله ي بعد آنزیم نوترکیب بتاگلوکوزیدازتعیین خصوصیات شده و با آنزیم صنعتی Novozyme 188 مقایسه گردید.
مقدمه
سلولز فراونترین ماده آلی تجدیدپذیر و یک پلی مر طبیعی است که سالانه چهل میلیارد تن از آن در طبیعت تولید می شود.سلولز به وفور در ضایعات کشاورزي و پسماندهاي شهري وجود دارد - . - 1 هیدرولیز آنزیمی سلولزنیازمند همکاري سه آنزویم اندوگلوکاناز و سلوبیوهیدرولازو بتاگلوکوزیدازاست - . - 2 بتاگلوکوزیداز هیدرولیز باندهاي بتا –دي –گلوکوزیدیک را کاتالیز می کندو نقش هاي متفاوت مهمی رادر بیولوژي ایفا می کند مانند هیدرولیز سلولیگوساکاریدها وسلوبیوز به گلوکز - . - 3 سلوبیوز مهار کننده ي قوي براي آنزیم هاي اندوگلوکاناز و اگزو گلوکاناز است و براي ساکاریفیکاسیون کامل سلولز باید سلوبیوز حذف شود . - 4 -
افزودن بتاگلوکوزیداز سرعت تجزیه ي سلولز را به دلیل حذف سلوبیوز مهار کننده افزایش می دهد - . - 5 گلوکز که محصول نهایی عمل آنزیم بتاگلوکوزیداز است می تواند براي تولید سوخت هاي زیستی مانند اتانول استفاده شود . - 6 - براي تولید آنزیم بتا گلوکوزیداز از مخمرهاي مختلف می توان استفاده کرد . در این میان مخمر پیکیا پاستوریس گزینه بسیار مناسبی می باشد .
از سال 1984تا کنون از پیکیا پاستوریس براي تولید حدود 300 پروتئین خارجی استفاده شده است. استفاده از پروموتور AOX1 - الکل اکسیداز - 1 در این میزبان که یکی از قویترین و قابل تنظیم ترین پروموتورها است مزیت بسیار خوبی به شمار میرود، علاوه براین پیکیا پاستوریس توانایی بالایی در پذیرش پایدار یک یا چندین نسخه از پلاسمیدهاي بیانی در مکان هاي اختصاصی ژنوم خود دارد - . - 7
مواد و روش ها
براي تولید آنزیم Bgll از توالی این ژن در Aspergillus niger استفاده شد و این ژن توسط شرکت اینویتروژن و با در نظر گرفتن کاربرد کدون ها در مخمر پیکیا پاستوریس سنتز شد. به منظور بیان آنزیم بتا گلوکوزیداز در پیکیا پاستوریس از وکتور pPink- HC که حاوي پروموتور القایی AOX 1 و ژن مقاومت به آمپی سیلین و ژن سازنده ي آدنین بود استفاده شد.
ترنسفورماسیون مخمر توسط وکتورهاي نوترکیب بیانی با روش الکتروپوریشن صورت گرفت و مخمرهاي حاوي ژن بر روي محیط انتخابی PAD گزینش شدند و توسط PCR با پرایمرهاي رفت وبرگشت اختصاصی ژن وجود ژن در این مخمرها تایید شد. براي تولید آنزیم بتاگلوکوزیداز در حجم بالا از محیط بیانی BMGY و القاي متانولی استفاده شد و در نهایت با سانتریفیوژ کردن محیط مایع رویی که حاوي آنزیم بتاگلوکوزیداز ترشحی بود جدا شد.
توسط ژل SDS و نمایان شدن باندهاي مربوط به آنزیم بتاگلوکوزیداز بیان موفق این آنزیم در مخمر تایید شد. با استفاده از سنجش فعالیت آنزیم با سوبستراي PNPG مشخص شد که آنزیم تولید شده فعال است. پروفایل دمایی ، پروفایل pH، فاکتور هاي پایداري دمایی و Km، V max وKi در غلظت هاي مختلف سوبسترا براي آنزیم آزاد , و آنزیم تجاري Novozyme 188 اندازه گیري شده و با همدیگر مقایسه شد.
نتایج و بحث
بعد از مقایسه ي جایگاه وکتور p Pink ووکتور نوترکیب p Pink- Bgll بر روي ژل الکتروفورز و تایید اینکه وکتور نوترکیب حاوي ژن است، با روش الکتروپوریشن p Pink- Bgll به مخمر پیکیا پاستوریس منتقل شد - شکل - 1 پس از گزینش مخمر هاي ترنسفورم شده توسط محیط انتخابی PADو روش PCR آنزیم بتاگلوکوزیداز توسط محیط بیانی BMGY تولید شد. مقداري از آنزیم تولید شده بر روي ژل SDS برده شد و باندهاي مربوط به آنزیم در ژل تایید کرد که آنزیم توسط مخمر تولید شده است - شکل . - 2 به دلیل تفاوت در گلیکوزیلاسیون دو باند در روي ژل رویت شد.
شکل - 2 آنزیم بتاگلوکوزیداز ترشح شده توسط مخمر پیکیا پاستوریس بر روي ژل پلی اکریل آمید 12 درصد. چاهک - 1 مارکر پروتئینی Takara Code 3452، چاهک 5،4،3، - 2 غلظت هاي مختلف از آنزیم بتاگلوکوزیداز ترشح شده که نشان دهنده ي دو باند 100و120 کیلو دالتونی مربوط به آنزیم می باشد. با روش سنجش میزان فعالیت آنزیم ،با استفاده از سوبستراي PNPG ، فعال بودن آنزیم تولید شده تایید گردید.
پروفایل دمایی و پروفایل pH اندازه گیري شده نشان داد که آنزیم بتاگلوکوزیداز تولید شده توسط پیکیا پاستوریس و آنزیم تجاري Novozym 188 پروفایل دمایی و پروفایلpH یکسانی دارند، دماي بهینه براي فعالیت این دو آنزیم 65 درجه ي سانتیگراد وهمچنین pH بهینه ي فعالیت هر دو آنزیم 4/5 به دست آمد. اندازه گیري پایداري دمایی براي آنزیم بتاگلوکوزیداز ترشح شده توسط مخمر و همچنین آنزیم تجاري Novozyme 188 نشان داد که آنزیم تجاري دراکثر دماها، پایداري دمایی بالاتري نسبت به آنزیم تولید شده در پیکیا پاستوریس دارد .
اندازه گیري Km و Vm نشان داد که آنزیم تجاري داراي Km پایین تر و Vm بالاتري نسبت به آنزیم تولید شده در مخمر می باشد ولی در مقابل Ki به دست آمده از این دو آنزیم نشان داد که آنزیم تولیدي توسط مخمر در برابر مهار سوبسترایی پایداري بیشتري دارد که این موضوع اهمیت بسیار زیادي در بخش صنعت دارد - نمودار - 1، - جدول . - 1
