بخشی از مقاله
چکیده
نگرانی از وجود آفلاتوکسین در مواد غذایی و خطراتی که این سم برای سلامتی دارد، باعث پیدایش راههای مختلف حذف و یا کاهش این سم شده است از جمله، روشهای کنترل بیولوژیک قارچ توسط ریززندههای دیگر. در این تحقیق از باکتری باسیلوس سوبتیلیس جدا شده از مزارع پسته به عنوان عامل کنترل زیستی برای کاهش میزان آفلاتوکسین تولید شده توسط قارچ آسپرژیلوس پارازیتیکوس استفاده شد.
در روزهای دوم - انتهای فاز رشد - و پنجم - انتهای فاز ثابت - کشت باکتری، مایه رویی کشت به کمک سانتریفیوژ جداگردیده و در محیط مایع در معرض قارچ آسپرژیلوس قرار گرفت. پس از 4 روز مایع درون هر پلیت جداسازی و خالص سازی گردید و میزان آفلاتوکسین در پلیتهای مجاورسازی شده در مقایسه با پلیت کنترل به هر دو روش TLC وHPLC مورد بررسی قرار گرفت. طبق نتایج بدست آمده در شرایط زمانی مختلف، میزان کاهش آفلاتوکسین توسط مایه رویی کشت باکتری، بالای 90 درصد بود و بالاترین مقدار حذف آفلاتوکسین مربوط به کشت باکتری در محیط LB، روز دوم و دمای 37 درجه بود که این میزان تا 98/5 درصد گزارش شد.
مقدمه
آفلاتوکسین ها از متابولیت های ثانویه قارچ مزرعه ای آسپرژیلوس می باشد. این سم دارای انواع مختلفی بوده که خاصیت سرطان زایی و جهش زایی بالایی دارند. چهار نوع اصلی این سم شامل B1, B2, G1, G2 می باشد که نوع B1 سرطان زا ترین ترکیب شناخته شده است.
تاکنون آلودگی به آفلاتوکسین در مواد غذایی مختلفی گزارش شده است. ولیعمدتاً این آلودگی ها در بادام زمینی، انجیر، خرما، درختان میوه خشکبار - گردو ، بادام، پکان، یا گردوی امریکایی - ، پسته و دانه برزیلی - ، غلات - ذرت، برنج ، گندم، چاودار - ، فرآورده های أنها و ادویه جات وجود دارد.
کنترل بیولوژیک یکی از روشهای جدید در زمینه کاهش میزان آفلاتوکسین در محصولات مستعد به آلودگیهای آفلاتوکسینی بهویژه خشکبار میباشد.
در این روشها از میکروارگانیسمها یا متابولیت-های آنها جهت کاهش میزان آفلاتوکسین استفاده میشود. علی رغم مزایای استفاده از ریزاندامگان برای جلوگیری از رشد و تولید سم، از آنجایی که در نهایت هدف تامین سلامت یک محصول کشاورزی و غذایی است، لذا باید ایمنی استفاده از این گونههای زیستی مورد بررسی قرار گیرد. برای اینکه یک گونه از انواع ریز اندامگان به عنوان عامل کنترل زیستی یا آنتاگونیست تلقی شود باید دارای خصوصیات خاصی باشد از جمله:
- پایداری ژنتیکی؛
- کارابودن در غلظتهای کم؛
- تاثیر روی دامنه وسیعی از ریز اندامگان مهاجم و محصولات متفاوت؛
- داشتن نیازهای تغذیه ای ساده؛
- زندهمانی در شرایط نامساعد محیطی؛
- رشد روی سوبستراهای ارزان قیمت برای تکثیر در فرمانتور؛
- غیربیماریزا برای گیاه یا درخت میزبان؛
- عدم تولید متابولیتهای سمی برای انسان؛
- مقاومت به آفت کشهای رایج مورد استفاده؛
- و سازگاری با سایر تیمارهای فیزیکی و شیمیایی اعمال شده
تحقیقات متعددی در زمینه آفلاتوکسین انجام شده که می توان آنها را به چهار دسته کلی تقسیم نمود. بازداری رشد قارچ مولد سم، کاهش تولید آفلاتوکسین، بررسی تجزیه آفلاتوکسین توسط آنتاگونیست، بررسی میزان آلودگی خشکبار به قارچ و یا سم.[3,4] اما هیچ کدام از این تحقیقات اثر شرایط رشد آنتاگونیست را بر میزان کاهش سم مورد بررسی قرار ندادند. در این تحقیق سویه ای از باسیلوس سوبتیلیس جدا شده از مزارع پسته که خصوصیات آنتاگونیستی آن طی آزمایشات قبلی به اثبات رسیده، برای انجام این تحقیق انتخاب شد و در شرایط دمایی، زمانی و محیط کشت های مختلف کشت شد. سپس سوپرناتانت هر کشت جداشده و میزان تاثیر آن روی حذف آفلاتوکسین تولید شده توسط قارچ مورد بررسی قرار گرفت.
مواد و روشها میکروارگانیسم ها نتایج و بحث
سویه ای از باسیلوس سوبتیلیس جدا شده از مزارع پسته در بانک میکروبی بخش قارچ شناسی انستیتو پاستور ایران که خصوصیات آنتاگونیستی آن طی آزمایشات قبلی به اثبات رسیده، برای انجام این تحقیق انتخاب شد. باکتری مورد نظر پس از خروج از قریزر به مدت 24 ساعت در محیط غنی سازی BHI کشت داده شد. برای تهیه اسپورهای قارچ آسپرژیلوس پارازیتیکوس آن را در محیط SDA کشت داده و پس از 7 روز کشت در دمای 30 درجه، توسط محلول تویین80، سوسپانسیون اسپور قارچ تهیه گردید. سپس به کمک لام هموسیتومتر غلظت سوسپانسیون شمارش شده و روی 107 تنطیم شد و در یخچال نچهداری گردید.
شرایط رشد باسیلوس
برای بررسی اثر شرایط کشت روی میزان حذف آفلاتوکسین، یک لوپ از باکتری به 30 میلی لیتر از محیط TSB و LB منتقل شد و در دماهای 25، 30 و 37 درجه سانتی گراد به مدت 4،3، 2،1 و 5 روز نگهداری شد. برای هر آزمایش سه ارلن جداگانه درنظر گرفته شد. پس از آن محیط کشت در دور 14000 به مدت 5 دقیقه سانتریفیوژ شد و سوپرناتانت جدا شده و در فریزر نگهداری شد. پس از انجام آزمایشات آنتاگونیستی بر روی قارچ آسپرژیلوس پارازیتیکوس، شش سوپرناتانت باکتری که در شرایط مختلف کشت شده بودند و دارای بیشترین خاصیت آنتاگونیستی بودند، جدا شدند. این سوپ ها برای انجام آزمایشات بعدی نگهداری شدند. جدول 1 شرایط برداشت سوپرناتانت از کشت باکتری را نشان می دهد.
جدول .1 شرایط مختلف برداشت سوپرناتانت از کشت باکتری
