بخشی از مقاله
چکیده
ایران یکی از بزرگترین تولیدکنندگان نفت جهان است. با این وجود استفاده بیرویه از ذخایر نفتی و سوختهای فسیلی رایج، علاوه بر کاستن منابع محدود نفتی، موجب آلودگی محیط زیست میشوند. از این رو استفاده از سوختهای زیستی مورد توجه قرار گرفته است. اما قیمت تمام شده بالای تولید سوختهای زیستی به روشهای موجود، استفاده از آن را دچار محدودیت جدی کرده است. در این پژوهش یکی از جدیدترین روشهای تولید انرژی از منابع تجدیدپذیر، یعنی تولید بیودیزل به روش آنزیمی، ارائه میگردد. بیودیزل از منابع طبیعی و تجدیدپذیر مانند روغنهای گیاهی، چربیهای حیوانی، روغن دورریز آشپزی و ... طی فرآیندهای شیمیایی تولید می-شود.
در این مقاله ابتدا آنزیم لیپاز ازگونه باکتریایی باسیلوس سوبتیلیس تولید شده و سپس آنزیم حاصل بر روی نانوذره مغناطیسی Fe3O4 بدون مدیفیکاسیون تثبیت و در نهایت برای تولید بیودیزل از روغن آفتابگردان، به عنوان بیوکاتالیست بکاربرده شد. استفاده از بیوکاتالیست آنزیمی بجای کاتالیزورهای شیمیایی - اسیدی یا بازی - رایج جهت تولید بیودیزل، علاوه بر کاهش زمان و هزینه های تولید، موجب تولید گلیسیرین خالص تر به عنوان محصول جانبی گردید. همچنین تثبیت آنزیم بر روی نانوذرات مغناطیسی علاوه بر بالا بردن طول عمر آنزیم، موجب سهولت جداسازی آنزیم از محصول شده و امکان استفاده مجدد از آنزیم و درنتیجه کاهش هزینه های اقتصادی تولید سوخت را فراهم کرد.
مقدمه
لیپاز یکی از معمول ترین آنزیم هایی است که هیدرولیز و سنتز ترکیبات متنوع استری را کاتالیز می کند. این آنزیم به جهت تعداد سوبسترای بالایی که دارد به عنوان یک بیوکاتالیست با ارزش در صنایع غذایی، دارویی، شوینده و شیمیایی شناخته می شود . - Eggert, 2002 ;MT., 2002 - لیپازهای متنوعی از بسیاری از جنس ها و گونه های باکتریایی و قارچی استخراج و برای مقاصد گوناگون استفاده شده اند. از آنجا که لیپاز آزاد به سادگی غیرفعال شده و جمع آوری آن نیز برای استفاده مجدد، بخصوص در کاربردهای با مقیاس بالا مشکل است لیپازها اغلب بر روی بسترهای جامد تثبیت می شوند. این امر پایداری عملکردی و ساختاری آنها تحت شرایط واکنش افزایش داده و نیز امکان جمع آوری و استفاده دوباره از این بیوکاتالیست ها را فراهم می آورد.
تاکنون چندین روش برای تثبیت لیپازها برروی ساپورت های مختلف روش بوسیله روش هایی چون اتصالات کوالانت - P.Wang, 2006; Dyal A, 2003 - بدام اندازی - S.H.Lee, 2010; Keehoon Wona, 2005 - و یا جذب کردن - B. Chen M. M., 2007 - گزارش شده اند. ویژگی های مواد ساپورت کننده و روش های تثبیت بر روی فعالیت آنزیم لیپاز تثبیت شده تاثیر گذارند B. Chen E. M., ;P. Lozano, 2007 - . - 2007 در سال های اخیر نانوذارت مغناطیسی - - MNPs بر پایه اکسیدآهن توجه بسیاری را به خود جلب کرده اند. چرا که ویژگی های چندگانه آنها مانند زیست سازگار بودن، داشتن خاصیت سوپر پارامغناطیسیته، اندازه کوچک و سمیت پایین آنها بسیار شگفت انگیز است .
- Duguet E, 2006 - بخاطر داشتن منطقه سطح ویژه بالا و نیز امکان جداسازی آسان آنها از محیط واکنش به کمک یک آهن ربا، این نانوذرات در کاربردهای کاتالیتیکی آنزیمی بسیار بکار برده می شوند. - Lei L B. .Y., 2009; Lei L B. Y., 2008 - بیودیزل از طریق واکنش ترانس استریفیکاسیون چربی، روغن های گیاهی یا روغن های پسماند تولید می شود - شکل - 1 تا به عنوان یک جایگزین مناسب برای سوخت های فسیلی، علاوه بر کمک به حفظ ذخایر سوخت های فسیلی در جهت غلبه بر مشکلات زیست محیطی نیز به کمک بشر بیاید - . - S.H. Haa et al, 2007 در مقایسه با کاتالیست های شیمیایی، کاربرد لیپازها در تولید بیودیزل در سالهای اخیر بسیار مورد توجه قرار گرفته است.
چراکه در استفاده از لیپاز در بازیافت گلیسرول، کاتالیست و نمک نیاز به عملیات پیچیده ای ندارد . - Ban, 2001 - با این وجود آنزیم های خالص در دسترس، بطور معمول گران هستند و بطور عمده در مواد با ارزش تجاری بالا استفاده می شوند. در موادی که کیفیت تولید آنها بسیار مهم تر از پیچیدگی و صرفه اقتصادی مراحل تهیه و تولید آنها است . - Tamalampudi, 2008 - بنابراین ضرورت دستیابی به روشی با صرفه اقتصادی بالاتر از طریق سیستم بیوکاتالیستی برای وسعت بخشیدن به کاربرد لیپاز در تولید بیودیزل در مقیاس صنعتی بیش از پیش احساس می شود. در این تحقیق برای تولید آنزیم لیپاز خارج سلولی از گونه باکتریایی باسیلوس سوبتیلیس - Bacillus subtilis - استفاده شد. آنزیم حاصل پس از استخراج بر روی نانوذرات مغناطیسی Fe3O4 تثبیت شده و پس از سنجش کارآمدی آن در تولید بیودیزل از روغن دانه آفتابگردان، به عنوان یک نانوبیوکاتالیست جهت تولید بیودیزل گزارش شده است.
مواد و روش ها
در طی سنتز انجام شده کلیه واکنشگرها و حلالهای زیر از شرکتهای مرک - Merck - و سیگما - Sigma Aldrich - تهیه گردید: توئین - Tween 80 - 80، نوترینت آگار، CaCl2.2H2O، NaCl، MgSo4، متانول، استن، east extract، پپتون، روغن نارگیل، بافر فسفات - . - PBS همچنین در این تحقیق از باکتری باسیلوس سوبتیلیس موجود در پژوهشکده و نانوذارت Fe3O4 سنتز شده در پژوهشکده علوم پایه کاربردی جهاددانشگاهی دانشگاه شهید بهشتی استفاده شده است.
آزمون هیدرولیز توئین 80
برای انجام آزمایش تشخیص حضور آنزیم لیپاز در محیط کشت باکتری باسیلوس سوبتیلیس، محیط کشتی شامل 12 گرم پپتون، 5 گرم NaCl و 0/1 گرم CaCl2.2H2O و 10 میلی لیتر توئین 80، با pH برابر با 7/4 تهیه شد. سپس باکتری به صورت خطی در پلیت های حاوی محیط کشت ذکر شده کشت داده شد و به مدت 96 ساعت در دمای 35 درجه سانتیگراد انکوبه شد . - Davender Kumar,
تولید آنزیم لیپاز از باکتری باسیلوس سوبتیلیس
تولید آنزیم لیپاز خارج سلولی درون فلاسک های 250 میلی لیتر ارلن میر که هر کدام حاوی 50 میلی لیتر از محیط شامل پپتون 0/5 - % - ، 0/3 - yeast extract % - ، 0/25 - NaCL % - ، - % 0/05 - MgSo4 و روغن نارگیل - % 3/0 - در7/0 pH= می باشند، انجام گرفت. محیط کشت استرلیزه شده با 3/5 میلی لیتر - 4*108 cells/ml - از اینوکلوم باسیلوس سوبتیلیس مخلوط شده و سپس به مدت 72 ساعت در شیکر انکوباتور در دمای 34 درجه سانتیگراد با دور 200 rpm انکوبه شد.
در انتهای انکوباسیون مایع رویی حاصل از محیط کشت فرمانتور با استفاده از سانتریفوژ در 10000 g به مدت 10 دقیقه، جمع آوری شد. مایع رویی با استفاده از استن - 1:4 v/v - به مدت یک ساعت در دمای 4 درجه سانتیگراد تریت شده و سپس در دور 10000 g به مدت 10 دقیقه، سانتریفوژ شد. رسوب حاصل در 50 mM بافر فسفات - pH=7/0 - حل شده و برای استفاده جهت تثبیت در فریزر -18 درجه نگهداری شد.
تثبیت لیپاز بر روی نانوذرات Fe3O4
30 میلی گرم از نانوذره در5 میلی لیتر از بافر فسفات pH= 7/0 به مدت 5 دقیقه سونیکه شد. محلول بدست آمده درون 15 میلی لیتر محلول لیپاز- بافر فسفات ریخته شده و به مدت 24 ساعت در دمای اتاق به آرامی شیک شد تا آنزیم بر روی نانوذرات تثبیت شود. آنزیم تثبیت شده بوسیله آهن ربا از محیط جدا شده پس از سه بار شستشو با بافر فسفات، جهت انجام تست حضور آنزیم در 6 میلی لیتر بافر فسفات حل شد. تست حضور و اتصال آنزیم با استفاده از دستگاه طیف سنجی uv-vis در محدوده 280 نانومتر انجام شد. مقدار لیپاز متصل شده به نانوذره از محاسبه جایگزین شدن لیپاز در محلول رویی و محلول اصلی بدست آمد.
