بخشی از مقاله
چکیده
استفاده از بیوکاتالیست سلولی نسبت به آنزیم خالص تثبیتیافته براي تولید محصولاتی چون بیودیزل به دلیل مزایاي فراوان ازجمله عدم نیاز به انجام فرآیندهاي پیچیده و گران قیمت جداسازي، خالصسازي و تثبیت آنزیم در سالهاي اخیر توسط محققین مورد استفاده قرار گرفته است. در تحقیق حاضر، گونه قارچی رایزوپوس اوریزا تثبیت یافته بر نگاهدارنده طبیعی لوفا به عنوان کاتالیست واکنش ترانساستریفیکاسیون روغن کانولا با متانول به کار برده شد. پس از تعیین فعالیت آنزیمی بیوکاتالیستهاي تهیه شده، تاثیر زمان کشت سلولی و همچنین نوع منبع کربن موجود در محیط کشت بر فعالیت آنزیمی لیپاز مورد بررسی قرار گرفت. بیشترین فعالیت آنزیم لیپاز درون سلولی کاتالیزور در حضور روغن کانولا به عنوان منبع کربن پس از طی زمان کشت 48 ساعت حاصل شد. بیشینه بازده تولید بیودیزل در واکنش ترانس استریفیکاسیون روغن کانولا با متانول با استفاده از بیوکاتالیست سلولی تهیه شده به میزان 85 درصد در شرایطی بدست آمد که همان روغن به عنوان منبع کربنی محیط کشت بکار برده شد.
کلمات کلیدي: بیودیزل، کاتالیست سلولی، لوفا، لیپاز، ترانساستریفیکاسیون
مقدمه
امروزه بیودیزل - آلکیل استرهاي اسید چرب - به عنوان سوختی تجدیدپذیر، غیر سمی و زیست تخریبپذیر بسیار مورد توجه قرار گرفته است. بیودیزل از طریق استریفیکاسیون اسیدهاي چرب یا ترانس استریفیکاسیون روغنها و چربیها با الکلهایی که داراي زنجیره کوتاه هستند تولید میشود. سنتز این ماده بر اساس کاتالیست به کار رفته، به روشهاي شیمیایی و آنزیمی تقسیم میشود. در حال حاضر، روشهاي شیمیایی به دلیل کوتاه بودن زمان فرآیند و بازدهی بالا در صنعت مورد استفاده قرار میگیرند. نیاز به حذف کاتالیزور و مصرف انرژي بالا از جمله مشکلات این روشها بوده و همچنین وجود آب و اسید چرب آزاد در منبع روغن اولیه باعث ایجاد تداخل در واکنش میشود. استفاده از کاتالیزورهاي آنزیمی در فرآیندهاي تولید بیودیزل به جهت عدم نیاز به خالصسازي محصول و همچنین شرایط واکنشی متعادل مورد توجه قرار گرفته است .[1] سلولهاي قارچی تثبیتیافته میتوانند به عنوان منبع آنزیم درون سلولی عمل نمایند.
عدم نیاز به جداسازي و تخلیص آنزیم از مزایاي استفاده مستقیم از بیوکاتالیستهاي سلولی میباشد. گونههاي قارچی رایزوپوس داراي قابلیت تولید آنزیم لیپاز به صورت درون سلولی میباشند 2]و.[3 لوفا گیاهی با ساختار اسفنجی و تشکیل شده از مواد لیگنوسلولزي بوده که میتواند به عنوان نگاهدارنده طبیعی جهت تثبیت سلولی به کار رود. تخلل بالا، دانسیته پایین و حجم حفرات زیاد اسفنج لوفا موجب کارایی بالاي آن در تثبیت سلولها شده است .[4]تثبیت گونه قارچی رایزوپوس اوریزا بر نگاهدارنده طبیعی لوفا با هدف تولید آنزیم لیپاز براي تولید بیودیزل در این طرح به انجام رسید. تاثیر زمان کشت و منبع کربن موجود در محیط رشد بر فعالیت آنزیم لیپاز تولید شده مورد تحقیق قرار گرفت. توانایی این بیوکاتالیست سلولی به منظور انجام واکنشهاي ترانس استریفیکاسیون در تولید بیودیزل بررسی گردید.
مواد و روشها میکروارگانیسم و محیط کشت
گونه قارچی رایزوپوس اوریزا با مشخصه PTCC 5174 از کلکسیون میکروبی سازمان پژوهشهاي علمی و صنعتی ایران تهیه گردید. میکروارگانیسم بر روي اسلنت حاوي 4 درصد PDA به همراه 2 درصد آگار در دماي 24 ºC و به مدت 3 روز کشت داده شد. محیط کشت پایه به کاررفته جهت رشد این گونه قارچی شامل 70 گرم پلی پپتون، 1 گرم سدیم نیترات، 1 گرم پتاسیم دي هیدرژن فسفات و 0/5 گرم منیزیم سولفات 7 آبه بود . از روغن زیتون، کانولا و همچنین اولئیکاسید به عنوان منابع کربنی به میزان 30 گرم بر لیتر در محیط کشت استفاده شد.تهیه بیوکاتالیست سلولی لوفا به عنوان نگاهدارنده سلولی براي انجام عمل تثبیت گونه قارچی استفاده شد. نگاهدارنده لوفا به فرم دیسکی با قطر 1/5سانتیمتر برش داده شد.
قطعات لوفا سپس به مدت 10 دقیقه در آب مقطر جوشانده شده و در آون با دماي 70 ºC خشک شدند. تعداد 6 قطعه از لوفا به همراه 50 میلی لیتر از محیط کشت استریل شده و سپس به مقدار یک لوپ از اسلنت گونه قارچی رایزوپوس اوریزا به آن تلقیح شد. گرماگذاري ارلنهاي حاوي محیط کشت در دماي 30 ºC و دور 150 rpm به انجام رسید. نگاهدارندههاي سلولی حاوي توده سلولی تثبیت شده بر آن - BSP - از محیط کشت جدا و سپس با آب و استون به ترتیب به مدت 1 و 5 دقیقه شستشو داده شدند. سلول هاي تثبیت شده را در آون تحت خلا به مدت 3 روز در دماي محیط خشک کرده و سپس فعالیت آنزیم لیپاز آنها اندازهگیري شد.
مقدار توده سلولی تثبیت یافته بر هر نگاهدارنده از اختلاف وزن خشک قبل و بعد از تثبیت بدست آمد. فعالیت آنزیم لیپاز در دو واکنش هیدرولیز و ترانس استریفیکاسیون با متانول - متانولیز - سنجش شد. فعالیت هیدرولیز درون سلولی آنزیم با استفاده از دو قطعه بیوکاتالیست تهیه شده، تعیین گردید. مخلوط واکنش هیدرولیز شامل 2 گرم روغن زیتون، 9 میلیلیتر بافر استات 0/1 مولار - pH=5/6 - و 1 میلیلیتر کلسیم کلرید 0/05 مولار دربطري به حجم 50 میلی لیتر بوده که در شیکرانکوباتور با دور 250 rpm و دماي 30 ºC در مدت زمان 10 دقیقه به انجام رسید. فعالیت هیدرولیز برون سلولی نیز با اضافه کردن 1 میلی لیتر از محیط کشت به مخلوط واکنش تعیین گردید.
در انتها واکنش با اضافه کردن 20 میلی لیتر اتانول متوقف و مقدار اسید چرب آزاد شده بوسیله تیتراسیون با سود 0/1 مولار اندازهگیري شد. واحد فعالیت هیدرولیز آنزیم لیپاز - U - بر اساس تولید 1 μmol از اسیدهاي چرب در هر دقیقه گزارش شد. فعالیت متانولیز درون سلولی با واکنش استریفیکاسیون اولئیک اسید با متانول در حضور دو عدد از کاتالیستهاي سلولی تثبیتشده تعیین گردید. محیط واکنش شامل 1/93 گرم اولئیک اسید، 0/3 میلی لیتر بافر پتاسیم فسفات 0/1 مولار - pH=6/8 - و 0/07 گرم متانول در بطري با درب پیچی به حجم 50 میلی لیتر بوده که در شیکرانکوباتور با دور 150 rpm و دماي 30 ºC براي مدت زمان 2/5 ساعت به انجام رسید. واکنش با اضافه کردن 20 میلی لیتر از اتانول متوقف شده و مقدار اولئیک اسید باقیمانده در محیط بوسیله تیتراسیون با سود 0/1 مولار تعیین شد. میزان 1 μmol از متیل اولئات تولید شده در دقیقه به عنوان واحد فعالیت متانولیز درون سلولی آنزیم لیپاز تعریف شد .[2]
واکنش ترانس استریفیکاسیون روغن کانولا
واکنش ترانس استریفیکاسیون روغن کانولا با متانول در حضور بیوکاتالیست سلولی در شیکر انکوباتور با دور 150 rpm و در دماي 30 ºC براي مدت زمان 72 ساعت انجام شد. مخلوط واکنش شامل 1/93 گرم روغن کانولا به همراه 2 قطعه از بیوکاتالیست سلولی و 0/3 میلی لیتر از بافر پتاسیم فسفات بوده است. میزان 0/3 میلی لیتر از متانول در سه مرحله با فواصل زمانی 24 ساعت به مخلوط واکنش افزوده شد. بعد از طی زمان واکنش، مخلوط استري در 8000 rpm سانتریفوژ شده و بازده متیل استر در فاز روئی تعیین شد.
نتایج و بحث اثر مدت زمان رشد سلول بر فعالیت آنزیم
تاثیر زمان بر کشت سلول قارچی رایزوپوس اوریزا و تثبیت همزمان آن بر نگاهدارنده لوفا بر تغییرات فعالیتهاي آنزیمی لیپاز در جدول 1 ارائه شده است. دراین آزمایش منبع کربنی محیط کشت روغن زیتون بوده است. در مورد سلولهاي قارچی همزمان با رشد، تعداد و طول میسلیومها افزایش مییابد. در مرحله لگاریتمی، میکروارگانیسم با محیط کاملا سازگار بوده و درنتیجه تکثیر و تولید که بر اثر تغذیه میکروارگانیسم از محیط کشت صورت میپذیرد، شرایط بسیار مناسبی خواهد داشت.همزمان با رشد این گونه قارچی، فعالیت آنزیم لیپاز خارج سلولی روند افزایشی نشان داده است. با افزایش زمان کشت، آنزیم لیپاز از درون سلول به خارج آن تراوش کرده و درنتیجه آن فعالیت لیپاز خارج سلولی افزایش مییابد. فعالیتهاي آنزیم درون
