بخشی از مقاله
چکیده:
واکسن ها و آنتی ژن هاي مورد استفاده در درمان و پیش گیري عمدتا داراي آنتی ژن هاي غیر ضروري می باشند که حجم زیادي از فعالیت سیستم ایمنی را به خود مشغول می نمایند. این آنتی ژن ها در افزایش ایمنی میزبان نقشی نداشته و می توانند جهت بالا بردن ظرفیت تولید آنتی بادي بر علیه آنتی ژن اصلی حذف شوند.
در این راستا تولید آنتی ژن هاي خالص یا نوترکیب می تواند دررسیدن به افزایش ایمنی و بالا بردن سطح مقاومت میزبان موثر باشد . اما تولید پروتئین خالص عمدتا با هزینه بالائی تهیه شده و امکان استفاده آن در سطح وسیع مقدورنمی باشد و از طرفی در صورت استفاده از یک پرو تئین نوترکیب در زمانی که چندین آنتی ژن نیاز است که به حیوران تزریق شود نیز داراي هزینه بالائی می باشد.
در این راستا تهیه بخشی از پروتئین و یا اپی توپ آنتی ژن که داراي بیشترین تحریک کنندگی را در میزبان ایجاد نماید می تواند در کنار چندین اپیتوپ دیگر از چند آنتی ژن مختلف بشکل یک پپتید ترکیبی - fusion protein - از کارآئی بالائی براي ایجاد ایمنی در میزبان بکار گرفته شود. جنس باکتري کلستریدیوم و از جمله آن باکتري کلستریدیوم پرفرنژنس از مواردي است که در ایجاد بیماري در انسان و دام بسیار خطرناك می باشد.
در این راستا نویسندگان این مقاله در تحقیقات صورت گرفته سعی در شناسائی اپی توپ هاي توکسین هاي تولیدي این باکتري با توان آنتی ژنسیته بالا می باشند. در این پروژه ابتدا پرایمرهاي مختلف از ژن توکسین مورد نظر طراحی و قطعات مختلف بوسیله PCR تهیه گردید. سپس قطعات تهیه شده در پلاسمید PTZ57 داخل شده و پپتید هاي نوترکیب تولیدشده و بوسیله روش هاي مختلف ELIZA و dot blot و western blot مورد ارزیابی قرار گرفت.
این نتایج نشان داد که بخش هاي خاصی از توکسین می تواند در واکنش به آنتی بادي اختصاصی واکنشی مشابه با توکسین طبیعی داشته باشد. استفاده از این نتایج و بکار گیري آن در تولید پروتئین هاي ترکیبی می تواند در بکار گیري تولید واکسن و همچنین ایجاد ایمنی در میزبان براي چند پروتئین با حداقل هزینه مورد استفاده قرار گیرد.
مقدمه:
باکتري کلستریدیوم پرفرنژنس،یک باکتري بی هوازي،گرم مثبت ،باسیل شکل و اسپورزا است که به طور طبیعی در خاك ،آب و نواحی مختلف وجود دارد. - - 2 - - 1 این باکتري بر پایه تولید انواع توکسین هاي اصلی به 5 دسته تقسیم می شوند که شامل A تا E می شود
توکسین اپسیلون یکی از 4 توکسین اصلی است که توسط تیپ هاي D وB از کلستریدیوم پرفریژنس تولید می شود که باعث بیماري انتروتوکسمی کشنده می گردد، همین موضوع میتواند باعث تحمیل هزینه هاي بسیار سنگین اقتصادي در صنعت دامپروري شود. از این رو اهمیت بررسی مقابله با بیماري انتروتوکسمی از زاویه پیشگیرانه بر اساس تولید واکسن هاي نوترکیب مهم و حیاتی خواهد بود
مطالعات نشان داده اند که ژن کد کننده توکسین اپسیلون ، ژنی است که بر روي پلاسمید بزرگی قرار گرفته و با نام etx شناسایی می شود. این ژن داراي طول تقریبی bp 987 بوده وپس از ترجمه، پروتئینی با 311 اسید آمینه و وزن مولکولی kd 32.5 که یک پروتئین pore- forming است را ایجاد می کند واین شکل از پروتئین باعث نشت پتاسیم به خارج از سلول وفقدان مایع سلولی از درون سلول می شود
نکته مهم در مورد توکسین اپسیلون این است که این توکسین در ابتدا یک توکسین غیر فعال است که براي فعال شدن باید دچار چند برش پروتئولیتیک در نواحی C-terminal و N-terminal خود شود - 4 - - 1 - . این برش ها سبب بالغ شدن این پروتئین شده و تقریبا اختصاصیت و سمیت توکسین را تا 1000 برابر نسبت به توکسین نابالغ افزایش می دهد.این برشهاي پروتئولیتیک می توانند توسط پروئینازهایی همچون تریپسین و کموتریپسین که به مقادیر زیادي در دستگاه گوارش میزبان وجود دارند،ایجاد شوند
دراین راستا شناسایی ژن کد کننده این توکسین به همراه نواحی مختلف آن و همچنین ساختار پروتئین و شاخص هاي آنتی ژنیک - اپیتوپ - درون پروتئین از اهمیت ویژه اي برخوردار خواهد بود. بنابراین آنچه که به عنوان یک روش جامع براي این بررسی به نظر می رسد استفاده از روش کلونینگ براي ایجاد توکسین هاي نوترکیب خواهد بود
در این روش می توان آنتی ژن هایی از کل ژن کدکننده توکسین و یا قطعاتی از ژن که ممکن است خاصیت آنتی ژنیک داشته باشند را تولید کرده و اینترکشن هاي بین آنتی بادي نرمال وتوکسین هاي نوترکیب ایجاد شده را بررسی کرد.پس با استفاده از روشهاي بیوتکنولوژي و کلونینگ قطعات مختلف ژن کد کننده این توکسین می توان امکانی براي شناسایی اختصاصی اپیتوپ هاي توکسین ،ارزیابی توانایی آنها در تحریک سیستم ایمنی و در نهایت بهینه کردن تولید واکسنهاي نوترکیب ایجاد کرد.
مواد و روشها:
ابتدا بر اساس ژن هاي ارائه شده به بانک ژنی ، ژن توکسین اپسیلون مورد بررسی قرار گرفت . با توجه به نرم افزار هاي مختلف - EXpasy،Blast ، - Generuner طراحی چندین پرایمر از کل ژن و توالی درون ژن بر اساس ساختار ثانویه مولکول پروتئین با استفاده از ابزار هاي بیوانفورماتیکی - ساختمان ثانویه توکسین اپسیلن و طراحی پرایمر هاي مورد نیاز با توجه به محدوده α-helix و β-sheet توسط نرم افزار CLC main بدست آمده است - تهیه گردید. در این راستا پرایمر هاي طوري طراحی شدند که در موقعیت هاي مختلف و خارج از محدوده هاي α-helix و β-sheet هاي پروتئین قرار گیرند. اندازه قطعات نیز به شکلی تهیه گردید که داراي ابعاد مناسب براي فرآیند کلونینگ باشند.
پس از ساخت پرایمر ها ابتدا با DNA باکتري که قبلا از باکتري خالص جدا سازي شده است مورد آزمون قرار گرفت و پس از تایید، با برنامه PCR مناسب قطعات مورد نظر بررسی تکثیر گردید. قطعات تکیثر شده با توجه به اندازه پیش بینی شده ارزیابی و سپس با استفاده از روش استخراج از ژل خالص سازي گردید. در این مرحله محصولات مختلف PCR خالص سازي و سپس جهت انجام کلونینگ مورد استفاده قرار گرفت.
قطعات مورد نظر توسط کیت TA cloningدر پلاسمید ptz 57 وارد شده و درباکتري E.coli DH5α ترنسفورم گردید. باکتري هاي فوق در محیط LB آگارمحتوي آمپی سیلین براي مدت 18-16 ساعت در دماي 37 درجه رشد داده شد. کلون هاي سفید به دست آمده را در محیط کشت مایع آمپی سیلین دار به مدت 18-16 ساعت در شیکر انکوباتور 37 درجه رشد داده و براي تائید نهایی از کلون هاي مورد نظر PCR گذاشته شد تا صحت قطعات کلون شده تایید گردد. سپس پلاسمید هاي هر کلون به روش قلیایی استخراج شده و در مرحله بعد از رسوب سلولی نمونه ها ومحلول رویی آنها SDS- PAGE و Western blot گذاشته شد تا الگوي پروتئینی نمونه ها مورد بررسی قرار گیرد.
بحث و نتیجه گیري :
با توجه به نتایج حاصل از blast مشخص شده که پرایمر هاي طراحی شده کاملا اختصاصی بوده و هیچگونه مشابهتی با دیگر موارد ندارد. از طرفی نتایج PCR حالت هاي مختلف نیز نشان داد که تهیه محصول PCR به وسیله پرایمرهاي طراحی شده کاملا اختصاصی بوده و باند هاي مشاهد شده - شکل - 1 داراي اندازه هاي پیش بینی شده می باشد. جدول 1 ترکیب پرایمر هاي استفاده شده را نشان می دهد.
شکل و جدول :1 ترکیب قعطات PCR با استفاده از پرایمر هاي مختلف
نتایج حاصل از SDS-PAGE رسوب سلولی نمونه هاي 1و 2و9و 14 و باکتري E.coli DH5α نشان داد که الگوي پروتئینی قطعات نسبت به الگوي پروتئینی E.coli DH5α کاملا تغییر کرده است. براي بررسی بیشتر، آزمون Western Blotting انجام شد تا مشخص شود که آیا این تغییر در الگوي پروتئینی با هدف آزمایش مطابقت داشته است و آیا در الگوي پروتئنی جدید توانایی اتصال به آنتیبادي وجود دارد؟
قطعات نام برده در وسترن بلات باند تشکیل دادند که نشان دهنده وجود اپیتوپ مربوط به آنتی بادي اختصاصی آنتی ژن اپسیلون توکسین در این قطعات میباشد. با توجه به اینکه قطعات انتقال داده شده مربوط به نواحی مختلف توکسین می باشند بررسی حاضر نشان می دهد که اپسیلون توکسین حاوي چند اپی توپ اختصاصی آنتیبادي می باشد. - بدون تصویر -
