بخشی از مقاله
چکیده
شناسائی گونه Pythium aphanidermatum عامل مرگ گیاهچه و پوسیدگی ریشه گیاهان زراعی موجب به کار بردن استراتژي هاي درست مدیریت این بیمارگر می شود. در این مطالعه طی سالهاي 1384 تا 1388 از مزارع چغندرکاري مناطق مختلف ایران نمونه برداري انجام شد. از مجموع 49 جدایه جمع آوري شده شش گونه پی تیوم براساس کلید واندر پلاتز و نیترینک شناسایی شد.
این گونهها شامل 27 - جدایه - Pythium aphanidermatum، 5 - جدایه - Pythium ultimum، 2 - جدایه - "Pythium Group"G، 1 - جدایه - Pythium deliense، 1 - جدایه - Pythium oligandrum و 13 - جدایه - .Pythium sp بودند. با توجه به اینکه شناسائی گونه پی تیوم با استفاده از صفات مورفولوژیک مشکل و زمانبر می باشد، از نشانگر RAPD براي شناسائی جدایه هاي P. aphanidermatum استفاده گردید.
نتایج نشان داد که در جدایه هاي P. aphanidermatum آغازگر 10 نوکلئوتیدي OPA-15 ایجاد یک قطعه تقریبی 2000 جفت بازي - bp - و آغازگر OPB-08 ایجاد دو قطعه تقریبی 1000 و 1850 جفت بازي - bp - نمود. این سه قطعه از تمام جدایه هاي P. aphanidermatum مورد بررسی بدست آمد. الگوي بدست آمده در جدایه هاي P. aphanidermatum با هیچکدام از جدایه هاي P. ultimum، P. oligandrum، P. deliense، Phytophthora drechsleri، Fusarium solani و Rhizoctonia solani شباهت نداشت . به این ترتیب دو آغازگر OPA-15 و OPB-08 توانایی شناسایی جدایههاي P. aphanidermatum از گونه هاي دیگر پی تیوم و سایر قارچهاي مسبب پوسیدگی ریشه چغندرقند را دارا میباشند.
-1 مقدمه:
یکی از عوامل مهم مرگ گیاهچه و پوسیدگی ریشه چغندرقند در اکثر مناطق چغندرکاري ایران قارچ پی تیوم می باشد که هر ساله خسارت زیادي به این محصول وارد می کند. از آنجائیکه کلیه گونه هاي پی تیوم بیماریزا نیستند و بیماریزائی گونه هاي مختلف می تواند متفاوت باشد، همچنین علایم بیماريهاي گیاهچهاي با عامل Pythium sp.، Rhizoctonia solani، Phytophthora drechsleri و Aphanomyces cochlioides اغلب مشابه هستند، بنابراین شناسائی سریع و دقیق عامل بیماري منجر به اتخاذ روشهاي مناسب براي کنترل بیمارگر میگردد . - 3 -
شناسائی و تفکیک این بیمارگرها با روشهاي سنتی وقت گیر بوده و به مطالعات میکروسکوپی گسترده نیاز دارد. در سالهاي اخیر، چندین روش مولکولی مبتنی برDNA براي ردیابی و شناسائی گونههاي مختلف پیتیوم توسعه یافتهاند که دقت بالایی در تفکیک در سطح گونهها داشتهاند . - 6 - ویلند و سان داك در سال 2000 نشان دادند که تکثیر توالی ژن اکتین و محل ITS ژن rRNA با PCR، شناسایی بیمارگرهاي چغندرقند در سطح جنس را ممکن میسازد.
آنها توانستند با این روشها بیمارگرهاي چغندرقند شامل Aphanomyces cochlioides، Pythium ultimum، Fusarium oxysporum ، Cercospora beticola، Phoma betae و Rhizoctonia solani را ردیابی کرده و شناسایی کنند - . - 9 بر طبق تحقیقات قبلی گونه P. aphanidermatum به عنوان یکی از مهمترین عوامل مرگ گیاهچه و پوسیدگی ریشه چغندرقند بوده و از مناطق مختلف کشور گزارش شده است - . - 5 این پژوهش به دنبال شناسائی جدایه هاي P. aphanidermatum عامل بیماري پوسیدگی ریشه از سایر عوامل مولد پوسیدگی ریشه چغندرقند از نشانگرRAPD استفاده نمود.
-2 مواد و روشها:
2 -1 نمونه برداري و جداسازي جدایه ها :
طی سالهاي 1384 تا 1388 از مزارع چغندرکاري مناطق مختلف کشور از جمله استانهاي آذربایجان غربی، خراسان، اصفهان، فارس، البرز، کرمانشاه، لرستان، مرکزي و همدان گیاهان بالغ داراي ریشه پوسیده به آزمایشگاه منتقل شدند و عوامل بیماريزا از بافتهاي پوسیده جدا و خالص سازي شد.
2-2 شناسائی مورفولوژیک:
جدایه هاي پی تیوم بر اساس کلید واندر پلاتز و نیترینک مورد شناسائی قرار گرفت - . - 7 این خصوصیات مرفولوژیک شامل نوع اسپورانژیوم - کروي، انگشتی و یا لپ دار - ، تزئینات ااوگونیوم - صاف یا تزئین شده - گسترش ااوسپور در داخل ااوگونیوم - پلروتیک یا اپلروتیک - ، نحوه اتصال آنتریدي به ااوگونیوم - منوکلینوس یا دي کلینوس - و تشکیل تورم هیفی می باشد.
2-3 بررسی هاي مولکولی:
2-3-1 استخراج DNA ژنومی:
از کلیه جدایه هاي Pythium spp. و همچنین از دو جدایه Rhizoctonia solani ، سه جدایه Phytophthora drechsleri و دو جدایهFusarium solani براي مقایسه الگوهاي باندي با آغازگر هاي مورد استفاده، استخراج DNA با روش تغییر یافته دلاپورتا و همکاران انجام شد - . - 2 اندازه گیري کمیت و کیفیت DNA استخراج شده با استفاده از دستگاه اسپکتروفتومتر و الکتروفورز در ژل 0/8 درصد و رنگ آمیزي با اتیدیوم بروماید انجام گرفت.
2-3-2 نشانگر : RAPD
به منظور ردیابی سریع جدایه هاي قارچی موجود با استفاده از نشانگر RAPD از دو آغازگر OPA-15 - 5' TTCCGAACCC-3' - و OPB-08 - 5'GTCCACACGG-3' - استفاده شد. واکنش زنجیره اي پلی مراز براي انجام RAPD در حجم نهایی 25 میکرولیتر براي هر واکنش انجام گرفت. حجم مورد نیاز DNA در یک واکنش، 1/5 میکرولیتر با غلظت 50ng/μl، 2/5 میکرولیتر 10x buffer، 2 میکرولیتر 2/5 dNTP میلی مولار، 1/8 میکرولیتر MgCl2 با غلظت 25 میلی مولار، 1 میکرولیتر با غلظت 30 ng/μl آغازگر، 0/2 میکرولیتر - یک واحد - آنزیم SmarTaq پلی مراز بود.
واکنش زنجیره پلی مراز براي آزمون RAPD در دستگاه ترموسایکلر با مراحل زیر صورت گرفت: 5 دقیقه واسرشت سازي اولیه در 94 °C، 40 چرخه شامل واسرشته سازي به مدت 45 ثانیه در دماي 94°C، اتصال به مدت 45 ثانیه در دماي 34°C، توسعه به مدت 100 ثانیه در دماي 72°C و یک مرحله 10 دقیقه اي توسعه نهایی در دماي °C 72 براي تکمیل طول قطعات تکثیر شده در واکنش. سپس الکتروفورز محصولات واکنش RAPD در ژل آگارز 1/2 درصد با ولتاژ 100، رنگ آمیزي ژل در اتیدیوم بروماید و عکس برداري در دستگاه مستند ساز ژل انجام گرفت. در نهایت الگوي نواربندي ژنوتیپ ها روي ژل مشخص شد. شناسائی گونه P. aphanidermatum بر اساس حضور - یک - و عدم حضور - صفر - هر یک از باندهاي مورد انتظار به صورت اعداد صفر و یک انجام گردید.
