بخشی از مقاله
چکیده
سیلیمارین یک ترکیب فلاونوئیدي است که از دانههاي گیاه خارمریم بهدست میآید و داراي خواص آنتیاکسیدانی میباشد. چالکون سنتاز نقش کلیدي در مسیر بیوسنتزي فلاونوئیدها دارد. بنابراین شناسایی ژن/ خانواده ژنی آن در گیاه خارمریم حائز اهمیت میباشد. بدین منظور با جمع آوري دادههاي توالی موجود در مورد خانواده ژنی چالکون سنتاز در سایر گیاهان و هم ردیفی آنها، نواحی حفظ شده و متنوع مشخص شده و چهار آغازگر دژنره - دو آغازگر رفت - F1, F2 - و دو آغازگر برگشت - - R1, - R2 بر اساس نقاط حفظ شده این ژن طراحی شد. قطعات ژنی جهت تکثیر در واکنش زنجیرهاي پلیمراز از رقم مجار حاصل شدند. قطعه ژنی تکثیر شده با استفاده از جفت آغازگرهاي F1R2 از رقم مجار در ناقل مناسب همسانهسازي شد.
نتیجه تعیین توالی نشان داد که ژن چالکون سنتاز در گیاه خارمریم، داراي دو اگزون و یک اینترون 208 - باز - که مکان آن کاملا حفظ شده است. سپس شش آغازگراختصاصی - سه آغازگر رفت و سه آغازگر برگشت - جهت تکثیر cDNA از روي RNAي کل رقم مجار درسیستم RACE طراحی گردید. قطعات cDNA ي تکثیر شده در 3'RACE و 5'RACE در ناقل مناسب همسانه سازي و سپس تعیین توالی شدند. توالی کامل cDNA ي ژن چالکون سنتاز از همپوشانی توالیهاي 5'RACE و 3'RACE شناسایی گردید که قالب باز خواندنی آن داراي 1239 باز بوده و شامل اگزون یک 244 - باز - و اگزون دو 1182 - باز - میباشد که بهترتیب 63 و 349 اسیدآمینه را رمز میکنند.
کلمات کلیدي: خارمریم، سیلی مارین، ژن چالکون سنتاز، تکثیر سریع انتهاي cDNA ، توالی کامل cDNA
مقدمه
فلاونوئیدها گروه خاصی از محصولات طبیعی، پلیفنلی و پانزده کربنه گیاهی هستند که از پیش سازهاي مشتق از فنیل پروپانوئید و استات تولید میشوند و موجب انواع اعمال فیزیولوژیکی و اکولوژیکی مختلف در گیاهان میشوند - . - 3 مهمترین فلاونوئیدهاي میوه گیاه خارمریم - از خانواده کاسنی - 1 عبارتند از سیلیبین، ایزو سیلیبین، سیلیکریستین و سیلیدیانین که مجموعه آنها تحت عنوان سیلیمارین شناخته شده که از عصاره متانولی خشک شده دانه گیاه خارمریم استخراج میشود. سیلیمارین داراي خواص آنتیاکسیدانی میباشد و به عنوان یک داروي موثر در درمان مسمومیت کبدي، سرطان، هپاتیت و ایدز شناخته شده است - - 5
در این میان نقش آنزیم چالکون سنتاز به عنوان یک آنزیم کلیدي در مسیر بیوسنتز شیمیایی ترکیبات فلاونوئیدي از اهمیت ویژهاي برخوردار میباشد و واکنش تبدیل یک مولکول -Pکوماریل کوآنزیم A و سه مولکول مالونیل کوآنزیم A به نارینجنین چالکون را کاتالیز میکند - . - 4 ژن چالکون سنتاز مورد مطالعه تاکنون در گباهان، داراي دو اگزون و یک اینترون بوده به جزء گل میمون2 که داراي یک اینترون دیگر در اگزون دو است. توالی نوکلئوتیدي اگزون دو نسبت به اگزون یک حفظ شده تر است وتوالی اسیدآمینه چالکون سنتاز به طور کلی شامل چهار مکان حفظ شده است که جایگاه فعال آنزیم محسوب میشوند. اگزون یک و اگزون دو به ترتیب 64-37 و حدودا 340 اسید آمینه را رمز میکنند.
مکان اینترون کاملا حفظ شده - از قانون GT-AG پیروي میکند - اما از لحاظ اندازه در گونههاي مختلف از کمتر از 100 تا چندین کیلوباز متغییر است - . - 1 ژنهاي رمزکننده چالکون سنتاز از طیف تاکسونومیک گستردهاي از گیاهان شامل خزهها، سرخسها، بازدانگان، دولپهایها و تک لپهایها جداسازي شدهاند - - 4 اما تا کنون هیچگونه گزارشی در مورد توالی ژن/ خانواده ژنی چالکون سنتاز از گیاه خارمریم یا گیاهانی از جنس مربوطه - Silybum - منتشر نشده است. شناسایی ژن / خانواده ژنی چالکون سنتاز گیاه خارمریم گامی مؤثر در یافتن راهکارهاي هوشمندانه براي افزایش تولید مواد مؤثره دارویی و ارزشمند این گیاه خواهد بود.
مواد و روشها
کشت گیاه: بذر رقم اصلاح شده مجار از پژوهشکده بیوتکنولوژي کشاورزي تهیه گردید. بذور طبق روش حسنلو و همکاران - - 2 ضدعفونی و براي ایجاد دانه رست روي محیط پایه MS کشت شدند و پس از مرحله چهاربرگی به گلدان حاوي خاك مزرعه در گلخانه - ~ 27Cº - انتقال یافتند.
همردیفی توالیهاي مربوطه و طراحی آغازگر:3 اطلاعات موجود در مورد خانواده ژنی چالکون سنتاز در گیاهان مختلف از بانک دادههاي توالی4 جمع آوري و دسته بندي شدند. سپس توالیهاي مربوطه با استفاده از نرم افزار Clustal W همردیف شدند و بر اساس نواحی حفظ شده این خانواده ژنی به ویژه در گیاهان همان تیره - آستراسه - دو آغازگر دژنره رفت F1 - و - F2 و دو آغازگر دژنره برگشت R1 - و - R2 طراحی شد.
استخراج DNA ژنومی : از برگ رقم مجار در مرحله رزتی گیاه نمونه برداري صورت گرفت و DNA ژنومی آن ها با کیت - Core bio - Core-one استخراج گردید. کیفیت و کمیت DNA توسط اسپکتروفوتومتري و الکتروفورز ژلی بررسی شد.
تکثیر قطعات ژنی و همسانه سازي قطعه موردنظر: شرایط مناسب جهت تکثیر قطعات ژنی مورد نظر از روي DNAي ژنومی رقم اصلاح شده مجار با استفاده از جفت آغازگرهاي F1R1، F1R2، F2R1 و F2R2 در واکنش زنجیره اي پلیمراز5 تعیین گردید. محصولات PCR توسط الکتروفورز روي ژل % 1 اگاروز بررسی شدند. قطعه تکثیر شده توسط جفت آغازگر F1R2 به منظور تعیین توالی، در ناقل - Promega - pGEM-T Easy Vector وارد و در باکتري DH5 همسانه سازي شد.
طراحی آغازگرهاي اختصاصی ژن چالکون سنتاز: سه آغازگراختصاصی رو به جلو و سه آغازگر اختصاصی برگشتی جهت انجام PCR و سیستم RACE طراحی شدند.
استخراج RNA کل و تیمار آن با آنزیم :DNase استخراج RNA کل از بافت تر گلبرگ رقم اصلاح شده مجار با استفاده از محلول ترایزول6 صورت گرفت. کمیت و کیفیت RNA توسط دستگاه پیکودارپ و همچنین الکتروفورز ژلی بررسیشد و به منظور حذف آلودگیDNA در استخراج RNA ي کل از آنزیم - Promega - DNase استفاده شد.
تکثیر سریع انتهاي 7 - RACE - cDNA و همسانه سازي آن: جهت تکثیر توالی بین ابتدا و انتهاي قطعه تکثیر شده از ژن و انتهاي 3' و یا 5' از روي رشته RNAي پیک از 3' RACE - جهت شناسایی توالی انتهاي - cDNA 3' و 5' RACE - جهت شناسایی توالی انتهاي - cDNA 5' استفاده شد. قطعات تکثیر شده در سیستم 3'RACE و - Invitrogen - 5' RACE به منظور تعیین توالی، در ناقل - Promega - pGEM-T Easy Vector وارد و در باکتري DH5 همسانه سازي شدند.
نتایج و بحث
در زمان شروع این پژوهش اطلاعات توالی در مورد خانواده ژنی چالکون سنتاز از گیاهان مختلف در بانک دادههاي توالی یافت شد که همگی آنها جمع آوري و همردیف شدند. کمترین میزان شباهت میان این توالیها 59 درصد برآورد گردید. از آنجایی که حتی در قسمتهاي حفظ شده تر توالی نیز تنوع زیادي مشاهده شد توالیهاي موجود بر اساس رده بندي گیاهان دسته بندي گردید تا بخشهاي حفظ شدهتر مربوط به هر خانواده شناسایی شوند و آغازگرها بر اساس نواحی حفظ شده در گیاهان هم تیره با گیاه خار مریم طراحی شدند.اندازه باندهاي تکثیر شده حاصل از جفت آغازگرهاي F2R1 و F2R2 با اندازه باندهاي مورد انتظار - بر اساس توالی رونوشت ژن چالکون سنتاز در سایر گیاهان - بهترتیب با اندازه 747 bp و 592 bp مطابقت داشتند، اما اندازه باندهاي تکثیر شده با استفاده از جفت آغازگرهاي F1R1 و F1R2 بزرگتر از اندازه مورد انتظار - به ترتیب 1016 bp و - 861 bp بودند.
محل اینترون بین آغازگر F1 و F2 است بنابراین جفت آغازگرهاي F1R1 و F1R2 در PCR قادر به تکثیر قطعه اینترونی ژن میباشند و باندهاي تکثیر شده از این جفت آغازگرها با اندازه مورد انتظار به همراه قطعه اینترونی مطابقت داشت.نتیجه حاصل از تعیین توالی F1R2 نشان داد که ژن چالکون سنتاز در گیاه خار مریم همانند اغلب گیاهان مورد مطالعه، داراي دو اگزون و یک اینترون - 208 bp - آن هم در مکان کاملا حفظ شده است. اندازه باند تکثیر شده حاصل از جفت آغازگرها در 5'RACE و 3'RACE با اندازه باندهاي مورد انتظار - بر اساس توالی رونوشت ژن چالکونسنتاز در سایر گیاهان - به ترتیب با اندازه 779 bp و 863 bp مطابقت داشت - شکل. - 1 توالی کامل cDNA ي ژن چالکون سنتاز گیاه خارمریم از همپوشانی 5'RACE و 3'RACE بهدست آمد.
این توالی داراي 1406 باز است که اگزون یک و اگزون دو به ترتیب شامل 244 باز و 1182 باز میباشند قالب باز خواندنی آن، 1239 باز است که کدون آغازین - ATG - در مکان +35 و کدون پایانی - UGA - در مکان+ 1271 قرار دارد و 412 اسید آمینه را رمز کرده و اگزون یک و اگزون دو به ترتیب 63 و 349 اسیدآمینه را رمز میکنند. بیشترین تشابه را در سطح نوکلئوتیدي به ترتیب با cDNAهاي ژن چالکونسنتاز Callistephus chinensis - %80 - ، - %74 - Gerbera hybrida 2 نشان داد - شکل - 2 و در سطح پروتئین بیشترین تشابه را بهترتیب با پروتئین چالکون سنتاز در گیاه - %90 - Chrysanthemum x morifolium، - %86 - Callistephus chinensis وhybrida Gerbera - %85 - نشان داد - شکل . - 3
