بخشی از مقاله
- چکیده:
مالاریا از مهمترین بیماریهاي ناقل زاد است که سالانه 2 میلیون نفر در اثر ابتلا به آن جان خود را از دست می دهند و اکثر قربانیان آن را کودکان تشکیل میدهند.
ناحیه اندمیک مالاریا در ایران شامل نواحی گرمسیر جنوب و جنوب شرقی یعنی استان هاي سیستان و بلوچستان ،کرمان و هرمزگان است. در این منطقه انگل هاي مالاریا - پلاسمودیوم فالسیپاروم-1 پلاسمودیوم ویواکس - 2 بوسیله آنوفل هاي ناقل به خصوص آنوفل استفنسی منتقل می شوند. به نظر می رسد برهمکنش بین انگل و دیواره معده میانی به علت وجود کربوهیدراتها در سطح انگل و لکتین در دیواره معده میانی ناقل است که نشاندهنده اهمیت مطالعه ساختار ژن لکتین و پروتئین هاي مرتبط با فیبرینوژن - FBN - در گروه لکتین می باشد.
آنوفل استفنسی ها از شهرستانهاي ایرانشهر، نیکشهر، چابهار و سرباز استان سیستان و بلوچستان به عنوان ناحیه اندمیک و شهرستان لامرد دراستان فارس به عنوان ناحیه غیراندمیک مالاریا جمع آوري شده اند. بهینه سازي شرایط تکثیر، منجر به شناسایی و تعیین توالی قطعه 382bp مرتبط با FBN9 در آنوفل استفنسی شد که شامل یک اگزون با127 اسید آمینه است. مقایسه با توالی آنوفل گامبیه نشان داد که این توالی داراي %90 مشابهت در سطح اسید نوکلئیک و %92 مشابهت در سطح اسید آمینه است. همین تشابه بالا این مسئله را در ذهن ایجاد کرد که شاید بتوان از این توالی در طراحی واکسن هاي مهار کننده انتقال بیماري مالاریا استفاده نمود.
- مقدمه:
بیماري مالاریا با سابقه طولانی ، شیوع گسترده اي در تاریخ ایران داشته است. قبل از اینکه مبارزه با این بیماري در ایران شروع شود حدود %60 جمعیت کشور در نواحی اندمیک مالاریا زندگی می کردند و مالاریا عامل 30 تا %40 مرگ ومیرها در این نواحی بوده است.
اولین مطالعات مالاریا در ایران توسط محققین انستیتو پاستور و همکاران آنها صورت گرفت و درمان موارد مالاریا از سال 1945 آغاز شد.
در سال 1947 به منظور کنترل پشه هاي آنوفل، آفت کش DDT براي اولین بار در روستایی واقع در نزدیکی تهران که جزء مناطق Hyper- endemic محسوب می شد آزمایش گردید و این امر منجر به کاهش انتقال مالاریا در این ناحیه شد. در طی سالهاي 1956-1948 روش هاي مبارزه علیه این بیماري میزان آلودگی را در اغلب مناطق اندمیک کاهش داد. در سال 1957 برنامه ریشه کنی مالاریا 3 - MEP - در ایران شروع شد و این برنامه توانست تا سال 1980 سیکل انتقال در ناحیه شمال کشور را متوقف کند. اما میزان آلودگی در جنوب کشور افزایش یافت که این مسئله ناشی از مشکلات اجرایی در بکارگیري برخی از روشهاي مورد استفاده بود، بنابراین در سال 1980 برنامه ریشه کنی مالاریا به برنامه کنترل مالاریا 4 - MCP - تغییر یافت
بیماري مالاریا توسط انگل پلاسمودیوم و از طریق گزش پشه آنوفل از یک فرد به فرد دیگر منتقل می شود، انگل داراي دو سیکل اجباري در بدن حشره - سیکل جنسی - و بدن میزبان انسانی - سیکل غیر جنسی - است. پلاسمودیوم ها به گونه اي خود را از سیستم ایمنی ناقل مخفی می کنند که در نهایت تعداد کافی ازآنها بتوانند به غدد بزاقی پشه وارد شده و از آنجا طی خونخواري بعدي به میزبان انسانی انتقال یابند
شواهد نشان می دهد که بر همکنش بین ناقل – انگل، عامل حمله پارازیت در مهره داران و حشرات میزبان است 3 - و. - 4 برخی محققین پیشنهاد می کنند که برهمکنش بین ناقل و انگل بوسیله کربوهیدرات سطح پارازیت و لکتین سطح معده تعیین می شود .
لکتینها به عنوان پروتئین هاي متصل شونده به کربوهیدرات و یا گلیکوپروتئینها با منشأ غیرایمنی ویا به عنوان پروتئینهاي متصل شونده به کربوهیدراتهاي مجزا از آنزیم و آنتی بادي به حساب می آیند
شیوع بیماریهایی که بوسیله ناقلین منتقل می شود از جمله مالاریا در حال افزایش است که نشان دهنده عدم موفقیت راههاي کنترل موجود این بیماري می باشد. لذا بنظر می رسد که شناسایی مکانیزمهاي موثر در برهمکنش بین ناقل و انگل راهکار مناسبی براي مهار چرخه زندگی انگل و شیوع این بیماري می تواند باشد. از آنجا که یکی از مهمترین قسمتهاي چرخه جنسی اتصال اووکینت به دیواره معده میانی از طریق پروتئین لکتین است، لذا تعیین ساختار ژن پروتئین لکتین و پروتئین هاي وابسته بعنوان هدف این تحقیق طراحی گردید
- مواد و روشها:
- جمع آوري نمونه ها و استخراجDNA
آنوفل استفنسی ها از شهرستانهاي ایرانشهر، سرباز، نیکشهر و چابهار از استان سیستان و بلوچستان به عنوان ناحیه اندمیک و شهرستان لامرد در استان فارس به عنوان ناحیه غیراندمیک مالاریا و آنوفل کلیسیفاسیس از شهرشتان چابهار و نیکشهر در استان سیستان و بلوچستان جمع آوري شده اند. پس از جمع آوري پشه ها از طریق کلید تشخیصی آنوفل هاي ایران - - 8 شناسایی و سپس DNA آنها استخراج شد.
- استخراج از طریق روش collins و به ترتیب زیر صورت گرفت:
هر پشه در 50μL محلول لیز کننده - شامل0/08 NaCl مولار، 0/16 Tris -HCl مولار، 0/06 EDTA مولار با 8 Ph و %0/5 SDS - در یک تیوپ 1/5 µl بوسیله دستگاه گریندل هموژن و به مدت 30 دقیقه در دماي 65 درجه سانتیگراد انکوبه شد. سپس 17µl استات سدیم 4 درجه سانتی گراد به آنها اضافه شد و تیوپ ها به مدت 30 دقیقه در یخ قرار داده و سپس در دور 12000rpm به مدت 10 دقیقه سانتریفوژ شدند، محلول رویی جدا و DNA بوسیله الکل -20 درجه سانتیگراد و سانتریفوژ به مدت 20 دقیقه رسوب داده شد. پس از آنکه DNAها به طور کامل خشک شدند ddH2O 20 µl به آنها اضافه شد و براي استفاده هاي بعدي در دماي 4 درجه سانتیگراد نگهداري شدند.
- مراحل PCR و : Gel extraction
PCR بوسیله یک جفت پرایمر FBN9A, B که بر اساس توالی همین ژن در آنوفل گامبیه طراحی شده بود، انجام گرفت.
کلیه واکنش هاي PCR در حجم 25µl انجام گرفت. مخلوط PCR شامل1µl از هر پرایمر، 0/2µl آنزیم Taq است. در شرایط زیر واکنش پیش رفت: 5 دقیقه در 94ºc سپس 35 سیکل دناتوراسیون در 94ºc به مدت 1دقیقه، اتصال پرایمرها در 60ºc به مدت 1 دقیقه و طویل شدن رشته ها در 72ºc به مدت 1 دقیقه و پس از این 35 سیکل طویل سازي نهایی در72ºc به مدت 5 دقیقه پایان یافت. از آنجا که پرایمرها اختصاصی گونه نبود علاوه بر باند380 bp مورد نظر باندهاي غیر اختصاصی نیز تکثیر شد که از طریق برش از روي ژل - gel - extraction و کیتهاي خالص سازي باند مورد نظر بریده شد و توسط دستگاه AB1 sequencer تعیین توالی شد.
- آنالیز یافته ها:
صحت توالی ها بوسیله نرم افزار Chromas بررسی و توالی هاي مربوط به چمعیت هاي مختلف آنوفل استفنسی بوسیله نرم افزار - 12 - CluctalX و - 11 - ClustalW با هم مقایسه و ردیف سازي شدند. درصدGC توالی ها و همچنین توالی اسید آمینه بوسیله نرم افزار - version 3.05, 1994, Hastings Software Inc - Gene Runner تعیین و با نمونه هاي موجود در GenBank مقایسه گردید. درخت فیلوژنی بوسیله نرم افزار ClustalX و - 5 - MEGA2 ترسیم شد.
- نتایج و بحث:
پس از بهینه سازي شرایط PCR ، قطعه اي به طول 382bp بوسیله پرایمرهاي FBN9 که از روي ژنوم آنوفل گامبیه - ناقل اصلی مالاریا در قاره آفریقا - طراحی شده بودند در جمعیتهاي مختلف آنوفل استفنسی جمع آوري شده از استانهاي سیستان و بلوچستان و فارس براي اولین بار تکثیر گردید و از روي ژل خالص سازي شد - شکل1 قسمت الف - . بررسی بوسیله نرم افزار Gene Runner نشان داد که این قطعه داراي 56/5 تا GC %57 بوده، کل طول این قطعه شامل یک اگزون است که پلی پپتیدي به طول 127 اسید آمینه را تشکیل می دهد.
مقایسه این توالی ها با یکدیگر نشان داد که این توالیها 97 تا %100 در سطح اسید نوکلئیک و اسید آمینه با هم شباهت دارند. وقتی این توالی ها با تنها توالی موجود در GenBank یعنی توالی همین ژن در آنوفل گامبیه - - AY341168.1 مقایسه شد مشخص گردید که توالی بدست آمده %90 در سطح اسید نوکلئیک و %92 در سطح اسید آمینه با توالی آنوفل گامبیه مشابهت دارد.
توالی پپتیدي با سایر توالیهاي مشابه در دیگر حشرات مقایسه شد و مشخص گردید که این توالی%92 با توالی فیبرینوژن در آنوفل گامبیه - AAR13732 - ، %67 با توالی پروتئین فیبرینوژن و فیبرینکتین در - EAT39569 - Aedes aegypti ، %65 با توالی پروتئین مشابه فیکولین در - ABC70685 - Aedes albopictus و %50 با پروتئین angiopoietin-like protein 2 در Aedes albopictus - AAV90673 - و در نهایت %47 با پروتئین CG1791-PA در دروزوفیلا ملانوگاستر - NP_572591 - مشابه است. درخت فیلوژنی براي تبیین ارتباط تکاملی این توالیها ترسیم شده است
Aedes aegypti و Aedes albopictus ناقلین ویروس بیماري تب دانگ هستند. به نظر می رسد از آنجا که فیبرینوژن توانایی اتصال به کربوهیدراتها را دارد - 7 - ، وجود توالی فیبرینوژن و فیکولین که داراي بخش فیبرینوژنی است در اتصال کربوهیدراتهاي سطح ویروس و انتقال ویروس به میزبان جدید مؤثر می باشد.
تشابه توالی بدست آمده با سایر پروتئین هاي فیبرینوژنی دلیل قاطعی بر اهمیت این پروتئین در اتصال به عوامل بیماریزا - انگل، ویروس و - … و تکمیل سیکل زندگی این عوامل در بدن پشه ها بوده و به نظر می رسد که می توان به کمک مطالعات تکمیلی و تحقیقات گسترده تر بر روي ساختار این ژن و توالی پروتئین هاي آن راهکارهایی را براي مهار این پروتئین و ممانعت از انتقال انگل مالاریا بوسیله آنوفل و دیگر عوامل در سایر ناقلین فراهم نمود.
شکل1 قسمت الف: محصول خالص شده قطعات 382 bp روي ژل %1/5 الکتروفورز شده است.
