بخشی از مقاله
چکیده
تاکسنومی سیانوباکتريها در سالهاي اخیر موضوع اختلاف نظر در میان جلبک شناسان بوده است. به همین دلیل تحقیقات زیادي برروي شاخصهاي مورفولوژیک و نیز خصوصیات فیزیولوژیکی به منظور شناسایی بهتر و دقیقتر صورت گرفته است. همچنین در دههاي اخیر تکنیکهاي مولکولی بویژه بررسی توالی ژن 16srRNA، براي شناسایی و رده بندي بسیار رایج و متداول گشته است.
در این مطالعه با توجه به اهمیت سیانوباکتريها در تجزیه ترکیبات نفتی، براي اولین بار نمونههاي جداسازي شده از مناطق آلوده و غیر آلوده به نفت استان خورستان مورد شناسایی مولکولی قرار گرفت. آنالیز بلاست از توالیهاي تکثیر شده 16s rRNA مشخص نمود سویههاي جدا شده از منطقه غیر آلوده به نفت Leptolyngbya sp. ISC38، Nostoc sp. ISC17 و Microcheate tenera ISC13 بودند که در پایگاه اطلاعاتی NCBI ثبت گردید. همچنین نمونههاي جداسازي شده از مناطق آلوده به نفت Phormidium sp. ISC27 و Nostoc sp. ISC32 بودند.
مقدمه
سیانوباکتريها با توجه به ماهیت پروکاریوتیک و فتوتروفیک خود، در دسته جلبکهاي پروکاریوت قرار میگیرند. ردهبندي سیانوباکتريهاقبلاًبر اساس صفات سیتولوژیک و مورفولوژیک استوار بود ولی در دههاي اخیر به دلیل اینکه ردهبندي سیانوباکتريها بدلایل مختلف، مانند تغییر در صفات مورفولوژیکی ایجاد انشعاب کاذب و صفات غلاف تحت تاثیر عوامل محیطی، با مشکلاتی مواجه شده، توجه به شناسایی مولکولی افزایش یافته است.
در این روش از توالی ژنهاي مختلف و مقایسه آنها با بانکهاي اطلاعات ژنی استفاده میگردد. بدین ترتیب با کمک PCR - Polymerase chain reaction - که امکان تکثیر ساده و سریع از یک قسمت مشخص از DNA را داده، میتوان براي آنالیز و مقایسه توالیها بهره برد. این مناطق مانند نشانگرهاي مولکولی ویژه براي شناسایی گونهها و روابط فیلوژنتیک آنها در سیانوباکتريها نقش بازي میکنند.
رایج ترین مارکر تاکزونومیک در پروکاریوتها 16s rRNA میباشد - . - 2 تاکنون گزارشهاي انتشار یافته شناسایی سیانوباکتريهاي ایران بیشتر مربوط به نمونههاي آبزي بوده است. از طرف دیگر، نمونههاي خاکزي که شناسایی شدهاند نیزعموماًمتعلق به خاكهاي شالیزارها هستند - . - 4 در این مطالعه با توجه به اهمیت سیانوباکتريها در تجزیه ترکیبات نفتی، براي اولین بار نمونههاي جداسازي شده از مناطق آلوده و غیر آلوده به نفت استان خورستان مورد شناسایی مولکولی قرار گرفت.
مواد و روشها
سویههاي سیانوباکتریایی از مناطق آلوده و غیر آلوده به نفت استان خورستان به روش پلیت آگار جداسازي و خالص سازي شدند. به این ترتیب که 100 میکرولیتر از سریال رقت 1 به 10 از نمونهها روي پلیتهاي محیط کشت جامد BG11 تلقیح گردیدند و در دماي 30 درجه سانتیگراد و تحت نوردهی دائم - 60 mol photon m-2 s-1 - رشد داده شدند. کلنیهاي سیانوباکتریایی رشد یافته روي سطح پلیتها با چندین بار کشت مجدد، خالص گردید. شناسایی اولیه با استفاده از کلید هاي جان و همکاران - - 2003، آناگوسنیدیس و کومارك - - 1190، دسیکاچاري - 1959 - و گیتلر 1935 انجام پذیرفت - . - 1
DNA نمونهها به منظور شناسایی مولکولی به روش Doyle & Doyle استخراج شدند. واکنش PCR با استفاده از دستگاه ترموسایکلر - Techne, TC.512 - در حجم 20 میکرولیتر صورت گرفت. به منظور انجام این واکنش از پرایمرهاي CYA359F, CYA781R و FD1,RD1 با غلظت هاي 1میکرولیتر از پرایمررفت و برگشت هر کدام با غلظت نهایی 0/5 پیکومول استفاده شد.
همچنین از PCR Master kit با غلظت 1X در حجم 10میکرولیتر به عنوان محلول پایه و غلظت 100 ng از DNA براي انجام واکنش PCR استفاده گردید. برنامه مربوط به پرایمرCYA106F ، CYA781R، سیکل اول شامل 5 دقیقه در 94 درجه، سیکل دوم شامل 1دقیقه در 94 درجه، 11 دقیقه در 60 درجه، و 1دقیقه در 72 درجه 34 - سیکل - و سیکل سوم شامل 12 دقیقه در 72 درجه و 5دقیقه در 4 درجه میباشد . برنامه مربوط به پرایمر FD1, RD1 سیکل اول شامل 3 دقیقه در 95 درجه، سیکل دوم شامل 30 ثانیه در 94 درجه، 40 ثانیه در 60 درجه، 90 ثانیه در 72 درجه 30 - سیکل - و سیکل سوم شامل 3 دقیقه در 72 درجه و 5 دقیقه در 4درجه میباشد - . - 3
پس از اتمام چرخه هاي PCR به منظور مشاهده الگوي باندي محصول PCR، الکتروفورز افقی با استفاده از ژل آگاروز 1/2 درصد با ولتاژ 85 ساعت به مدت 2 ساعت صورت گرفت. براي تعیین اندازه باند هر یک از نمونه ها از نشانگر مولکولی - Fermentase - 1 Kb مورد استفاده قرار گرفت. پس از رنگ آمیزي ژل به مدت 20 دقیقه با اتیدیوم بروماید، عکس برداري توسط دستگاه ژلداك UVP - امریکا - انجام شد.
به منظور تمیز کردن محصول PCR از کیت پاکسازي - Fermentase - استفاده شد و محصول باقیمانده در انتهاي ستون براي تعیین توالی به شرکت ژن فن آوران ارسال شد. توالیهاي بدست آمده بوسیله نرمافزار BioEdit - 7.0.5.3 - مورد ویرایش قرار گرفت و توالیهاي ویرایش شده سپس به روش Blastn در NCBI بلاست گردید و در صورت نداشتن همولوژي %100 در پایگاه اطلاعاتی Genbank ثبت گردید.
نتایج و بحث:
شکل 1 تصاویر باندهاي ناحیه تکثیر شده 16s rRNA را نشان میدهد. پرایمر CYA106F, CYA781R که براي سویههاي منطقه غیرآلوده به نفت استفاده شد توالیهایی با طول حدود 700 جفت باز - شکل -1 چپ - ولی پرایمر FD1,RD1 که براي سویههاي منطقه آلوده به نفت استفاده شد توالیهایی با طول حدود 1500 جفت باز را تکثیر نمود.
