بخشی از مقاله
چکیده
DNA میتوکندریایی برای مطالعه روابط تکاملی بین گونه های حیوانی به دلیل محافظه کاری در توالی های کدگذاری پروتئین، نرخ جایگزینی بالا در توالی های غیر کدگذاری و عدم وجود نوترکیب ژنتیکی مفید است هاپلوتیپهای شناسایی شده از37 نمونه شترهای دوکوهانه وتک کوهانه با استفاده تجزیه و تحلیل فیلوژنتیک با استفاده از توالی های ژن DNA میتوکندری می تواند به تمایز ژنتیکی زیر گونه و برآورد روابط فیلوژنتیک در گونه های مختلف Camelus از جمله Camelus Bactrianus و Camelus Dromedarius کمک کننده باشد.
در مطالعه حاضر، روابط فیلوژنتیکی درون جنس با استفاده از توالی های DNA میتوکندری ژن ATP6 مورد بررسی قرار گرفت. در کل 12 هاپلوتیپ با منشأ مختلف شناسایی شده است. که سهم شترهای تک کوهانه و دوکوهانه به ترتیب 5 و 7 می باشد. میزان تنوع نوکلئوتیدی در ژن ATP6تقریبا برابر و به میزان 0/00213 و 0/00235 به ترتیب برای شترهای تک کوهانه و دو کوهانه محاسبه شد. تاجیما D نیز برای هردو گونه منفی و عدم معنی دار مشاهده گردید . نتایج مربوط به آنالیزهای شبکه ای نیز مطابق با نتایج فیلوژنتیکی ارائه شده است.
.1 مقدمه
درک ما از زندگی یوکاریوتها، ریشه های آن، تنوع و پیچیدگی آن همه با مطالعات mtDNA شکل گرفته است .[1] که به عنوان مرکز متابولیسم انرژی و مبدل اکسیژن نهایی، نقش مهمی در زنجیره تنفس اکسیژن و اصلاح آدنوزین تری فسفات - ATP - با استفاده از ساختار آنها، آنزیم ها و انرژی آزاد شده از طریق فرایند فسفوریلاسیون اکسیداتیو مواد مغذی دارد. ازآنجایی که ژنوم میتوکندری در اندازه، ساختار و محتوا بسیار متنوع هستند[ 2 ]، دو نقش عمده تولید انرژی و حمایت از بیوسنتز میتوکندری ها، آن ها را به نتایج متنوع بیولوژیکی شامل تکثیر، تمایز و سازگاری تبدیل می کند
و همچنین متابولیسم انرژی میتوکندری نقش مهمی در تکامل و شکل گیری دارد. میتوکندری، یکی از ارگانهای سیتوپلاسمی در موجودات یوکاریوتی است[4]که عدم تقارن رشته در ترکیب نوکلئوتید یکی از ویژگی های قابل توجه ژنوم های میتوکندریایی حیوانات است. نوترکیب زیست شناسی در یک ژنوم پستانداران توسط هومولوگهای مجاور فعال می شود.
DNA میتوکندریایی برای مطالعه روابط تکاملی بین گونه های حیوانی به دلیل محافظه کاری در توالی های کدگذاری پروتئین، نرخ جایگزینی بالا در توالی های غیر کدگذاری و عدم وجود نوترکیب ژنتیکی مفید است .[6] درنتیجه در غیاب نوترکیب، تنوع فقط بوسیله جهش ایجاد می شود. روند جهش یک نیروی تکاملی عمده است که بر متغیرهای ژنتیکی و نتایج جایگزینی نوکلئوتیدها با ترکیبات ناقلین نادرست و یا حذف یا جای گذاری نوکلئوتیدهای نادرست، عمدتا به علت اشتباهات در تکرار کننده DNA است. پروسه ها در سلول، یا در تعداد کمتر از موارد به علت قرار گرفتن در معرض منفی عوامل محیطی است
تعیین میزان جهش واقعی از الگوهای اختلاف دنباله ای بین گونه ها و یا حتی از تغییر در بین گونه ها می تواند یک مشکل باشد، زیرا این امر باعث می شود که مفاهیم روشن در مورد بی طرفی جهش ها مشخص شود. هنگامی که جهش ها به طور کامل خنثی هستند، آنها اثرات مضر یا سودمندی بر زنده ماندن یا بازتولید ارگانیسم ندارند، و ایجاد آنها در یک جمعیت، یک احتمال است. از آنجایی که اکثر جهش ها مضر هستند و با انتخاب برداشته می شوند، جهش های بیشتری تولید می شوند که هرگز به عنوان پلی مورفیسم در یک جمعیت مشاهده نمی شوند. به همین علت سهم نسبی جهش های سودمند و بی طرف در فرآیند تکاملی یک مشکل مرکزی در زیست شناسی تکاملی است و درک فرآیندهای جهشی که شکل نامتقارن رشته را تشکیل می دهند، برای دانش جامع تکامل ژنوم، تاریخ جمعیت، جمعیت شناختی و استنباط دقیق فیلوژنتیک ضروری است
نرخ جهش بالاتر ژنوم میتوکندری نسبت به DNA هسته ای که احتمالا ناشی از ترکیبی است از کارایی پایین تر مکانیسم های تعمیر DNA میتوکندری و بیشتر"موتاژنیک" محیط داخلی داخل سلولی است[9] و به تولید گونه های اکسیژن واکنشی - ROS - در طی فسفوریلاسیون اکسیداتیو منجر شده است با این حال، مکانیسم ها برای کاهش احتمال انتقال جهش های پاتولوژیک mtDNA به فرزندان تکامل یافته اند.
سرعت سریع دنباله تکامل می تواند به دو عامل نرخ جهش بالا یا محدودیت عملکردی پایین مربوط شود. در واقع، نرخ بالای تکامل mtDNA ممکن است منجر به این فرض شود که بیشتر موتاسیون های mtDNA اساسا بی طرف هستند و به اثرات انتخاب طبیعی وابسته نیستند. علاوه بر این، وجود مناطق محافظت شده و کمتر حفظ شده در یک مولکول mtDNA مشابه و نرخ جهش بالاتری نسبت به DNA هسته را، برای مقایسه های هر دو در میان افراد از همان جمعیت و در میان گونه های مرتبط با دوردست مناسب می سازد
جهش مانع مهمی برای بینش جدید در زیست شناسی میتوکندری وکاربرد بالینی برای اختلالات mtDNA، عدم پذیرش عمومی برای دست کاری توالی mtDNA است.[11] چندین گزارش اخیر اثربخشی توالی نسل بعدی - NGS - را برای تشخیص اختلالات میتوکندری نشان داده اند.[12] تغییرات ژنوم میتوکندری به علت جهش در mtDNA در بیماری های مرتبط با میتوکندری مانند یک گروه از اختلالات ژنتیکی مادرزادی ارزیابی می شود. این مطالعه باهدف شناسایی جهش های موجود در ژن ATP6 شترهای ایران و بررسی تکاملی آن انجام گرفت.
.2 مواد و روشها
دراین پژوهش از شتر دو کوهانه و شتر تک کوهانه - C. Bactrianus ، - C. Dromedarius، به ترتیب 6 و 5 نفر از ایستگاه تحقیقات منابع طبیعی و امور دام استان اردبیل - شهرستان مشگین شهر - و با در نظرگرفتن عدم خویشاوندی جمع آوری گردید. DNA ژنومی از کل خون به روش متداول با استفاده از کیت استخراج GenAll استخراج شد.
به طور خلاصه، از طریق سیاهرگ وداجی خونگیری به عمل آمد واین نمونه های خون که با استفاده از 4 میلی لیتر لوله های Vacutainer حاوی - - 1 - EDTAمیلی گرم بر میلی لیتر - ازورید جگولار گرفته شده و قبل از تجزیه و تحلیل در دمای -20 درجه سانتیگراد تا زمان استفاده نگهداری شد. سپس بعداز استخراج DNA با استفاده از Nanodrop اندازه گیری شد.
تعیین کیفیت از طریق الکتروفورز 1 ژل آگارز مورد بررسی وبا استفاده از پلت فرم Illumina توالی یابی گردید و توالی کل ژنوم میتوکندریایی نمونه های مورد نظر از طریق سرهم سازی با استفاده از توالی مرجع از ژن ATP6 جدا و همراه با دریافت یکسری توالی شتردوکوهانه وتک کوهانه موجود از Genbank در وب سایت NCBI - http://Www.Ncbi.Nlm.Nih.Gov - ، مورد تجزیه و تحلیل قرار گرفت. یک کتابخانه با اندازه ورودی به طور متوسط 360 بازتولید شده و دردو خط از 100 بازی توالی به صورت Paired End با استفاده از سیستم Illumina Hiseq 2000شرکت ایلومینا - Illumina, San Diego, Ca - برای هر شتر توالییابی شد.
سپس توالی ها برای هم ترازی به [13] MEGA7منتقل شدند ودرخت ناهموار - NJ - برای بررسی توالیهای نژاد شتر و درخت فیلوژنتیک بین شتر و سایر نژادهای جغرافیایی با استفاده از نرم افزار MEGA ساخته شد. این نتایج با سایر توالی هایی که از GenBank بدست آمده مقایسه شده است. جهت بررسی تنوع جمعیت شاخص های شامل: تنوع هاپلوتیپ - Hd - ، تنوع نوکلئوتیدی - - و تفاوت های نوکلئوتیدی - N - در بین گونه ها از نرم افزار DNASP 5.10 استفاده شد و درانتهای تکمیل توالی های ژنوم میتوکندری شتر ها با استفاده از نرم افزارNetwork 4.6.1 به منظور شناسایی و ردیابی جهشهای haplotype فردی مورد آزمایش قرار گرفت.
.3 نتایج و بحث
نتایج ما بینش نسبت به تنوع ژنتیکی، تکامل فیلوژنتیک و مادری شتردوکوهانه را برای حفاظت و مدیریت بهتر منابع ژنتیکی شترها ارائه می دهد. توالی DNA برای شترهای دوکوهانه وتک کوهانه فقط برای 681 قطعه جفت باز از ژن ATP-6 بدست آمد. از 37 نمونه ATP- 6 در میان گونه های شترهای دوکوهانه وتک کوهانه، 12هاپلوتیپ یافت شدند. mtDNA هنوز اولین شاخص انتخاب برای تجزیه و تحلیل تکاملی است. این نقش مهمی در کشف تاریخ های تکاملی تنوع گسترده ای از ارگانیسم ها، به ویژه منشاء و تکامل خود از ریشه های آفریقایی دارد.
بررسی تمایز ژنتیکی زیر گونه ها و تخمین روابط فیلوژنتیک آنها را با استفاده از توالی ژنوم های میتوکندری به این نتیجه رسیدند که تمام حیوانات تجزیه شده بیانگر میزان قابل توجهی از تنوع هاپلوتیپ ها - اکثر نمونه ها دارای haplotypes منحصر به فرد - ، اما تنوع نوکلئوتید محدود است و تعداد کدون های متغیر در ژن های کد گذاری پروتئین PCG - ها - ، با بیشترین تفاوت در CO3 وکمترین تفاوت را در ATP6 نشان می دهد.[12]درک تاریخ تکامل موجودات زنده یک مشکل مرکزی در زیست شناسی است. تا همین اواخر توانایی کشف روابط تکاملی با مقدار اطلاعات توالی در دسترس DNA محدود شده است، اما فن آوری توالی جدید DNA تا حد زیادی این محدودیت را برداشته است.
