بخشی از مقاله
چکیده
هدف از پژوهش حاضر، شناسایی چند شکلی جایگاه ژنی زیر واحد بتاي هورمون محرك فولیکولی - FSHβ - ، در گوسفندان دو نژاد بلوچی و ایران بلک بوده است. براي این منظور نمونه هاي خون 100 راس گوسفند از دو نژاد آرمان و بلوچی واقع در ایستگاه عباس آباد مشهد جمعآوري و با حفظ زنجیره سرد به آزمایشگاه منتقل شد. استخراج DNA به روش نمکی بهینه یافته انجام و با استفاده از یک جفت آغازگر اختصاصی یک قطعه به طول 247 جفت باز از اگزون شماره دو این ژن به کمک واکنش زنجیره اي پلی مراز - PCR - تکثیر شد.
صحت قطعه تکثیري توسط الکتروفورز ژل آگارز 1/5 درصد مورد آزمون قرار گرفت. ردیابی چند شکلیها با استفاده از آنزیم HinfI و الکتروفورز محصولات حاصل از هضم آنزیمی روي ژل اکریل آمید انجام شد. در نتایج حاصل از هضم آنزیمی چند شکلی در قطعه تکثیر شده مشاهده نشد و همه نمونهها در جایگاه مورد مطالعه براي نشانگر آنزیمی HinfI داراي ژنوتیپ وحشی - AA - بودند
مقدمه
طرحهاي انتخاب در اصلاح نژاد حیوانات و گیاهان مبتنی بر ارزیابی هاي ژنتیکی است که در راستاي استراتژي هاي اصلاح نژادي مورد نظر انجام می گیرد. در حال حاضر، از میان تکنیک هاي مختلف مولکولی جهت به کار گیري در استراتژي هاي اصلاح نژادي، تکنیک MAS1 به عنوان ابزاري براي برنامههاي انتخاب با کارایی بیشتر در جوامع حیوانی و گیاهی مورد توجه قرار گرفته است. اصولا تکنیک MAS مبتنی بر ردیابی توارث لوکوسهاي صفت کمی - QTL - 2 سودمند درون شجره با کمک نشانگرهاي مولکولی میباشد
فعالیتهاي تولید مثلی در گوسفند تحت تاثیر تعداد زیادي ژن قرار دارند که در این میان هورمون FSH یکی از هورمون هاي اصلی در تولید مثل پستانداران است که براي رشد سلول هاي گونادو تروپینی، بالغ شدن آن ها و تولید سلول جنسی در طی گامه باروري ضروري است
هورمون محرك فولیکول نوعی گیلیکوپروتیین است که از هیپوفیز پیشین ترشح میشود و نقش مهمی را در تحریک رشد اندومترویوم، رشد و بلوغ فولیکولی، تولید و تخمک ریزي دارد . - 2 - زیر واحد بتاي هورمون محرك فولیکول داراي 111 اسید امینه است که توسط ژن FSHβ با 4262 جفت باز کد میشود
از طریق مطالعه جهشهاي ژن FSHβ در خوك و گاو گزارش کردند که جایگاههاي چند شکلی، ژن FSHβ ممکن است از دسته ژنهاي بزرگ اثر1 و یا این که در پیوستگی نزدیک با دیگر ژنهاي عمدهاي باشد که می تواند عملکرد تولید مثلی را کنترل نماید . - 4 - در نتیجه مطالعه ساختار ژنتیکی در این جایگاه ژنی قطعا می تواند اطلاعات ما در خصوص چگونگی کنترل مکانیسم هاي تولید مثل در دام هاي اهلی را افزایش دهد.
مواد و روش ها
در این پژوهش، از100 رأس میش نژاد آرمان و بلوچی متعلق به مرکز اصلاح نژاد دام شمال شرق کشور واقع در عباس آباد مشهد خونگیري به عمل آمد. نمونه هاي خون با حفظ زنجیره سرد به آزمایشگاه منتقل و استخراج DNA توسط روش نمکی بهینه یافته2 انجام شد. به منظور بررسی چند شکلی در ژن FSHβ با استفاده از تکنیک ,PCR-RFLP قطعه مربوط به جایگاه مورد نظر به طول 247 جفت باز با استفاده از آغازگر اختصاصی تکثیر شد.
واکنش زنجیره اي پلی مراز در حجم 18 میکرولیتر شامل ترکیبات با غلظتهاي، 7 میکرولیتر آب استریل دو بار تقطیر ، 8 میکرولیتر محلول MASTER KIT، /5 میکرولیتر از هر یک از آغازگرها ، 2 میکرولیتر DNA - با غلظت 50 نانوگرم - و تا رسیدن به حجم مورد نظر انجام گرفت. پروتکل حرارتی شامل 5 دقیقه واسرشت سازي اولیه در 95 درجه سانتی گراد، 35 سیکل واسرشت سازي در 94 درجه براي 30 ثانیه، اتصال آغازگرها در 49/5 به مدت 30 ثانیه، بسط در 72 در جه به مدت 45 ثانیه و بسط نهایی به مدت 10 دقیقه میباشد.
توالی آغازگر مورداستفاده براي جایگاه ژن FSHβ شامل: - R: ACACAGTGATGAGGGGCAC و - F:CCCATCTTTGGCATCAG بوده است . - 1 - پس از تکثیر از الکتروفورز ژل آگارز 1/5 درصد و رنگ آمیزي اتیدیوم بروماید براي رویت سازي باندها استفاده شد. براي شنایایی چند شکلیهاي موجود، محصولات PCR تحت تیمار هضم آنزیمی HinfI با ترکیباتی شامل 0/075. میکرو لیتر آنزیم، 0/35 میکرو لیتر بافر، 2/75 میکرو لیتر آب مقطر دو بار تقطیر و 2 میکرو لیتر محصول PCR در دماي 37 درجه به مدت 12 ساعت قرار گرفتند. نمونهها پس از تیمار آنزیمی، به علت وجود باندهایی با 23 جفت باز اختلاف با یکدیگر، الکتروفورز عمودي روي ژل اکریل آمید در ولتاژ 250 و به مدت 3 ساعت بار گیري و سپس با رنگ آمیزي نیترات نقره رویت سازي و تعیین ژنوتیپ شدند.
نتایج
اگزون 2 ژن FSHβ با 247 جفت باز به طور اختصاصی تکثیر شد. تیمار هضم آنزیمی محصولات به دست آمده و مقایسه با سایز مارکر 100 جفت بازي در نگاره 1 نشان داده شد. همان طوري که در نگاره دیده میشود در اثر برش آنزیمی دو قطعه 112 و 135 جفت بازي حاصل شد. در این پژوهش تنها یک فرم آللی - A - در همه نمونهها مشاهده و در نتیجه همه نمونههاي تعیین ژنوتیپ شده در هر دو نژاد آرمان و بلوچی داراي ژنوتیپ AA بودند.
شکل .1 نمونه اي از ژنوتیپ مشاهده شده - AA - با استفاده از آنزیم .HinfI نمونه هاي 3-2-1 آرمان ، 5-4 بلوچی و M سایز مارکر 100 جفت بازي میباشد.
