بخشی از مقاله
چکیده
زنگ زرد یا زنگ نواري یکی از مهمترین و خسارتزاترین بیماريهاي گندم در سراسر جهان است. موثرترین راه مقابله با این بیماري مقاومت ژنتیکی است و ترکیب ژنهاي مقاومت در یک رقم ، روش مناسبی براي ایجاد مقاومت پایدار در مقابل عامل بیماريزا میباشد. گزینش به کمک نشانگرها روش مناسبی براي بهبود کارایی انتخاب ژنوتیپ هاي مقاوم فراهم آورده است. هدف از این پژوهش شناسایی ژنهاي مقاومت موجود در ژنوتیپهاي گندم به کمک نشانگرهاي مولکولی است. بدین منظور جهت شناسایی ژنهاي مقاومت Yr5 و Yr10 به ترتیب در 17 و 30 ژنوتیپ ایرانی گندم نان از نشانگرهاي STS و SSR، استفاده گردید.
DNA به روش CTAB استخراج و باندهاي مرتبط توسط آغازگر YrSTS9/10 براي ژن Yr5 و Xpsp3000 مرتبط با ژن Yr10 ، بوسیله واکنش زنجیرهاي پلیمراز تکثیر شدند. نتایج حاصل نشان داد که ژن Yr5 در هیچیک از ارقام به جز شاهد مثبت وجود ندارد. همچنین مشخص گردید که ژن مقاومت Yr10 در شاهد مثبت و 8 رقم اصلاحی با تکثیر قطعه 260 جفت بازي وجود دارد ولی در سایر ارقام و شاهد منفی - Avocet`S` - وجود قطعه 240 جفت بازي نمایانگر عدم وجود ژن مقاومت بود.
مقدمه
بیماريهاي گیاهی تاریخچهاي به قدمت زراعت دارند و از ابتداي پیدایش کشاورزي به دلیل آسیب و صدمه به گیاهان، محدودکننده تولید بودهاند. خسارت این گروه تنشها سالانه از لحاظ صرف هزینه و نیروي انسانی قابل توجه است . - 17 - از اینرو اصلاح ارقام مقاوم به بیماريها میتواند از طریق افزایش عملکرد و کیفیت آن تأثیر بسزایی بر اقتصاد کشاورزي جهان داشته باشد.
از جمله این بیماريها، زنگها میباشند که گیاهان متفاوتی از جمله گندم را مورد حمله قرار میدهند. در واقع هر جایی که گندم کشت میشود، بیماري زنگ نیز وجود دارد - 7 - و شامل زنگ زرد1، زنگ برگ2 و زنگ ساقه3 میباشد. این بیماري توسط قارچهاي بازیدیومیست خانواده Puccinia ایجاد میشود. زنگ زرد یا زنگ نواري یکی از مهمترین و خسارتزا ترین بیماريهاي گندم در بسیاري از مناطق جهان است - 19 - و عامل مولد آن قارچ Puccinia striiformis f. sp. tritici است. این زنگ مهمترین بیماري خسارتآور غلات در ایران بوده و اولین بار در سال 1326 گزارش گردید . - 4 -
استفاده از مقاومت ژنتیکی روشی موثر، اقتصادي و از لحاظ زیست محیطی سالم جهت مبارزه با این بیماري می باشد. حدود 70 ژن در ارتباط با مقاومت گندم نسبت به بیماري زنگ زرد معرفی شدهاند 10 - و. - 2 استفاده از تعدادي از این ژنها در ارقام تجاري به دلیل ایجاد نژادهاي فیزیولوژیکی جدید بیفایده بوده است - 13 - اما ژنهایی مانند Yr5، Yr15، Yr17 و Yr29 میتوانند در ایجاد مقاومت پایدار به زنگ گندم مورد استفاده قرار گیرند. با این حال زمانی که ژنها بهصورت انفرادي به ارقام وارد شوند،مقاومت معمولاً کوتاهمدت و ناپایدار است - . - 6 لذا استفاده از ترکیب ژنهاي مقاومت، بهترین راه پایداري مقاومت یک رقم در مقابل عامل بیماريزا میباشد . - 17 -
گزینش به کمک نشانگرها فرصت مناسبی را براي بهبود کارایی انتخاب ژنوتیپهاي گیاهی که داراي ترکیبات دلخواهی از صفات هستند فراهم میکند، این روش بر پیوستگی بین یک نشانگر مولکولی و صفت موردنظر استوار است. در واقع به کمک این تکنیک میتوان ارزیابی مقاومت به بیماري را در غیاب بیمارگر و یا شناسایی ژن - هاي - مقاومت گیاه کامل را در مرحله گیاهچهاي و در سطح آزمایشگاه انجام داد. علیرغم گسترش نشانگرهاي ملکولی در شناسایی ژنهاي مقاومت، استفاده از آنها در ایران محدود بوده است. این پژوهش در راستاي بررسی و تعیین ژنهاي مقاومت به زنگ زرد در گندمهاي زراعی به کمک نشانگرهاي مولکولی طرحریزي گردید.
مواد و روشها
در این پژوهش تعداد 30 ژنوتیپ مختلف گندم مورد آزمایش قرار گرفتند که حضور ژن Yr5 در 17 ژنوتیپ و ژن Yr10 در همهي آنها بررسی شد. بذور این ژنوتیپها و ارقام استاندارد در سینی نشاء کشت شده و دو هفته بعد - مرحله دو برگی - برگهاي تازه برداشت شدند. سپس DNA ژنومی هر رقم به روش - 16 - CTAB، استخراج گردید. کمیت و کیفیت DNA استخراجی بوسیله دستگاه نانودراپ و الکتروفورز بر روي ژل اگاروز سنجیده شد و محلول با غلظت 100 نانوگرم در میکرولیتر تهیه و مورد استفاده قرار گرفت.
جهت شناسایی ژن مقاومت Yr5 از آغازگر STS، YrSTS9/10 و ارقام استانداردTriticum spelta var.album - شاهد مثبت - و Avocet`S` - شاهد منفی - استفاده گردید. همچنین براي تعیین ژن مقاومت Yr10 از آغازگر Xpsp3000، شاهد مثبت Moro و شاهد منفی Avocet`S` استفاده گردید. حجم کلی لولههاي واکنش 20 میکرولیتر شامل DNA ژنومی گندم با غلظت 50 نانوگرم، بافر 10X با غلظت 1X، کلرید منیزیم با غلظت 1/5 میلی مول، dNTP با غلظت 0/2 میلی مول، 10 پیکومول از هر آغازگر، 0/2 میکرولیتر Taq پلیمراز 5 - واحد در میکرولیتر - و آب دوبار سترون بود.
بعد از تهیه مخلوط، واکنش زنجیرهاي پلیمراز در دستگاه ترموسایکلر BIOER انجام گردید - جدول . - 1 آغازگر STS ، YrSTS9/10 که مبتنی بر توالی RGAP ژن مقاومت Yr5 است، در ارقام مقاوم قطعهاي به طول 439 جفت باز و در ارقام حساس قطعهي 433 جفت بازي ایجاد میکند که با توجه به اختلاف اندك باندهاي مثبت و منفی، الکتروفورز با ژل آگارز قادر به تفکیک این باندها از یکدیگر نبوده و تنها جهت تعیین موفقیت تکثیر ژنومی الکتروفورز افقی با ژل آگاروز %1 انجام گردید.
پس از اطمینان از صحت واکنش زنجیرهاي پلیمراز، محصولات به کمک ژل پلیآکریل آمید %6 واسرشت کننده، با ولتاژ 200 به مدت 5 ساعت تفکیک شدند . رنگآمیزي با نیترات نقره و عکسبرداري توسط اسکنر صورت گرفت. آغازگر Xpsp3000 در ارقام مقاوم باندي به طول 260 جفت باز و در ارقام حساس قطعهاي 240 جفت بازي ایجاد میکند. محصولات واکنش زنجیرهاي پلیمراز این آغازگر، با اتیدیوم بروماید رنگآمیزي و در الکتروفورز افقی با ولتاژ 85 به مدت 2 ساعت بر روي ژل آگاروز %1 تفکیک گردیدند.
نتایج و بحث
نتایج حاصل از واکنش زنجیرهاي پلیمراز براي نشانگر YrSTS9/10 و 17 رقم زراعی به کمک الکتروفورز با ژل اکریل آمید %6، نشان داد که قطعه 439 جفت بازي در هیچیک از ارقام وجود نداشت - شکل. - 1 براین اساس تنها در شاهد مثبت - Triticum spelta var. album - قطعه 439 جفت بازي و در سایر ارقام قطعهاي 433 جفت بازي مشابه با آنچه در شاهد منفی - Avocet`S` - مشاهده شد، تکثیر گردید.
شکل:1 الگوي باندي نشانگر YrSTS9/10، براي ژن مقاومت به زنگ زرد Yr5 در گندم - ارقام پس از نشانگر 50 جفت بازي به ترتیب مشخص شدهاند - با نشانگر Xpsp3000 ، یک قطعه260 جفت بازي در شاهد مثبت - Moro - و ارقام اصلاحی تجن، مغان2، آذر2، اینیا، البرز، کرخه، سرداري و هیرمند مشاهده گردید، که دلیل بر وجود ژن مقاومت Yr10 در آنهاست . در شاهد منفی - Avocet`S` - و مابقی 22 رقم مورد بررسی قطعه 240 جفت بازي مشاهده شد، که حاکی از عدم وجود این ژن مقاومت در این ارقام است - شکل . - 2
