بخشی از مقاله
چکیده:
پاتوتیپ انترواگرگیتیو اشریشیاکلی بر اساس توانایی آن ها در اتصال به کشت سلول تک لایه با عوامل چسبنده اگرگیتیو شناسایی می گردد. هدف از این مطالعه تعیین حضور و فراوانی سویه هاي انترواگرگیتیو از موارد عفونت هاي گوارشی از شهرستان سیرجان بر اساس تعیین ژن هاي وابسته به حدت بوده است. براي این منظور 120 نمونه باکتریولوژي از موارد عفونت هاي گوارشی در شهرستان سیرجان اخذ گردید.
اشریشیاکلی جداسازي و بر اساس ویژگی هاي بیوشیمیایی مورد تایید قرار گرفت. از تمامی جدایه هاي تایید شده و همچنین سویه هاي رفرانس O42 و MG1655، DNA به روش جوشاندن استخراج گردید. با استفاده از پرایمرهاي اختصاصی در آزمایش مولتی پلکس PCR جهت شناسایی ژن هاي EACE Probe، app و aggR اقدام شد. بر اساس نتایج از نمونه هاي باکتریولوژي 120 جدایه اشریشیاکلی مورد تایید قرار گرفت که 16 جدایه حداقل نسبت به یکی از ژن هاي مورد بررسی مثبت بود.
از میان جدایه هاي مورد آزمایش 13/3 درصد به عنوان پاتوتیپ انترواگرگیتیو تعیین گردید. 4 الگوي ترکیب ژنی شناسایی شد که 8 جدایه - 6/66 درصد - واجد ژن EACE Probe بودند که شایع ترین الگو بود. 6 جدایه 5 - درصد - از نظر ژن app مثبت بود، در حالی که فقط یکی از جدایه ها واجد ژن aggR بود همچنین یکی از جدایه ها از نظر حضور هر سه ژن مورد آزمایش مثبت بود.
مقدمه :
از بین عوامل پاتوژن مختلفی که منجر به عفونت هاي اسهالی می شوند جدایه هاي اشریشیاکلی خصوصیات بارزي را از خود نشان می دهند . - 3 - پاتوتیپ انترواگرگیتیو اشریشیاکلی - EAggEC - از مهمترین عوامل باکتریائی در رابطه با بیماریهاي اسهالی اندمیک و اپیدمیک در کشورهاي پیشرفته و در حال توسعه می باشد . - 2 - براي تشخیص سویه هاي اشریشیاکلی موجد اسهال، تشخیص عوامل حدت سویه هاي پاتوژنیک ضروري به نظر می رسد که این مهم با ابداع و فراگیر شدن تکنیک PCR در شناسایی ژن هاي حدت در جدایه هاي باکتریایی امکان پذیر شده است. - 4 -
شش گروه از پاتوتیپهاي اشریشیاکلی مولد اسهال به روش PCR و بر اساس شناسائی فاکتورهاي حدت توصیف شده اند که عبارتند از: انتروتوکسیژنیک اشریشیاکلی 1 - ETEC - ، انتروپاتوژنیک اشریشیاکلی 2 - EPEC - ، اشریشیاکلی تولید کننده شیگا توکسین 3 - STEC - ، انترواینویسیو اشریشیاکلی 4 - EIEC - ، انترواگرگیتیو اشریشیاکلی - EAggEC - و آدزین منتشره اشریشیاکلی . - 5 - 5 - DAEC - سویه هاي اشریشیاکلی انترواگرگیتیو اولین بار توسط خصوصیت اتصال توده اي به سلول هاي کشت سلول HEp-2 مشخص شدند.
اغلب سویه هاي انترواگرگیتیو اشریشیاکلی داراي پلاسمید حدت 60-65 مگا دالتونی است که جزء 1 کیلو بازي این پلاسمید داراي EAEC Probe می باشد که به طور وسیع در مطالعات اپیدمیولوژي مورد استفاده قرار می گیرد، همچنین این پلاسمید حاوي چندین ژن حدت نظیر ژن - aggR مربوط به رونویسی فیمبریه هاي - AAI,II,III، ژن کد کننده پروتئین ضد توده اي که به نام app نامیده می شود، ژن کد کننده انتروتوکسین مقاوم به حرارت انترواگرگیتیو - EAST-1 - 1و ژن سیتوتوکسین 104 کیلودالتونی به نام pet، ژن پروتئین ترشحی کریپتیکShf 6 جزو مهمترین ژن هاي حدت این پاتوتیپ اشریشیاکلی می باشد . - 7 -
با توجه به اهمیت ژنهاي EACE Probe، appو aggR در پاتوژنز و همچنین شناسائی سویه هاي انترواگرگیتیو اشریشیاکلی هدف از این مطالعه تعیین فراوانی پاتوتیپ انترواگرگیتیو در جدایه اشریشیاکلی از موارد عفونتهاي گوارشی، با شناسائی ژن هاي کد کننده فاکتورهاي EAEC probe، app و aggR به روش مولتی پلکس PCR در شهرستان سیرجان بوده است.
مواد و روش ها:
در این بررسی طی دوره زمانی شش ماه در سال 1388 از 120 نمونه مدفوع از موارد بیماریهاي گوارشی در شهرستان سیرجان تهیه گردید و نمونه ها در آزمایشگاه میکروبیولوژي جهت جداسازي اشریشیاکلی در محیط مک کانکی کشت داده شده، جهت تائید اشریشیاکلی بودن جدایه ها با آزمایشات بیوشیمیائی مورد بررسی قرار گرفتند بطوریکه با استفاده از محیط هاي اوره آگار، سیمون سیترات، ائوزین متیلن بلو، TSI و SIM نسبت به تعیین فرمول IMViC و تائید بیوشیمیائی سویه ها اقدام گردید.
از هر جدایه تائید شده، یک کلنی اشریشیاکلی انتخاب شده و تا زمان شروع آزمایشات با افزودن %30 گلیسرول در محیط تریپتیک سوي براث در دماي -20 درجه سانتی گراد ذخیره می شوند. براي انجام آزمایش PCR، ابتدا DNA به روش جوشاندن از هریک از باکتریها استخراج می شود براي این منظور باکتري ها در محیط مایع لوریا برتانی براث به مدت یک شب در دماي 37 درجه سانتی گرادکشت داده شده سپس 300 میکرولیتر از آن به مدت 30 ثانیه سانتریفیوژ می شوند و با افزودن 50 میکرولیتر آب مقطر استریل به مدت 10 دقیقه جوشانده می شوند در ادامه بمدت 30 ثانیه سانتریفیوژ گردیده و 2 میکرولیتر از مایع رویی به مخلوط 50 میکرولیتري حاوي پرایمر اختصاصی، دزاکسی نوکلئوتید، بافر PCR و آنزیم Taq DNA پلی مراز اضافه شد.
شرایط آزمایش مولتی پلکس PCR جهت شناسائی ژنهاي حدت مورد نظر، طبق روش پیشنهادي - Cerna JF et al., 2003 - صورت گرفت. از سویه استاندارد O42 بعنوان کنترل مثبت براي EAEC probe، app و aggR استفاده شد. همچنین سویه اشریشیاکلی غیر بیماریزاي MG1655 بعنوان کنترل منفی آزمایش PCR مورد استفاده قرارخواهدگرفت . - 1 - سکانس زوج پرایمر هاي بکار رفته جهت شناسائی ژنهاي حدت و وزن مولکولی محصولات PCR مورد انتظار در جدول شماره یک ذکر شده است.
نتایج و بحث:
نتایج آزمایش PCR در 120 جدایه اشریشیاکلی مورد مطالعه براي ژن هاي EAEC probe، app وaggR نشان داد که 16 جدایه حداقل نسبت به یکی از ژنها مثبت بوده و یکی از جدایه از نظر هرسه ژن مورد مطالعه مثبت قلمداد گردید - الگوي شماره . - 4 لذا فراوانی پاتوتیپ انترواگرگیتیو اشریشیاکلی در عفونت هاي گوارشی در شهرستان سیرجان 13/33 برآورد گردید.
بطور کلی جدایه هاي مثبت از نظر الگوي ترکیب ژنی در 4 گروه دسته بندي شدند که جزئیات آن در جدول شماره دو نشان داده شده است. بر اساس یافته هاي مطالعه حاضر ژن EAEC probe - الگوي شماره - 2 بیشترین فراوانی را داشته به طوري که 6/66 درصد 8 - جدایه - واجد ژن EAEC probe بود. مکانیسم بیماري زایی پاتوتیپ انترواگرگیتیو اشریشیاکلی به طور کامل روشن نشده است.
از این گذشته هتروژنسیتی قابل ملاحظه اي در فاکتورهاي حدت جدایه هاي انترواگرگیتیو اشریشیاکلی وجود دارد. این مطالعه با ارزیابی ژن هاي حدت شامل ,aggR EAEC probe و app توسط تکنیک مولتی پلکس PCR براي تشخیص انترواگرگیتیو اشریشیاکلی انجام شد. در سال 2004، Andresa Zamboni و همکاران 81 پاتوتیپ انترواگرگیتیو اشریشیاکلی در برزیل بررسی کردند که ژن aggR داراي بیشترین فراوانی بود این در حالی است که در مطالعه حاضر ژن aggR داراي کمترین فراوانی بود، همچنین ژن 15 aap درصد از نمونه ها را شامل می شد .
