بخشی از مقاله
خلاصه:
سیکلوتیدها دسته اي بزرگ از پپتیدهاي حلقوي ضد میکروبی هستند که فعالیت هاي زیستی متنوعی دارند که از آن جمله می توان به فعالیت ضد میکروبی، فعالیت ضد توموري، ضد ویروس نقص ایمنی اکتسابی، آنتاگونیسم نوروتنسین و... اشاره کرد. این دسته از پپتیدهاي حلقوي برخلاف پپتیدهاي حلقوي جدا شده از میکروارگانیسم ها، که به صورت غیر ریبوزومی سنتز می شوند، به صورت ریبوزومی سنتز شده و داراي ژن کدکننده هستند.
در این پژوهش دو جفت پرایمر از مناطق حفاظت شده توالی کدکننده سیکلوتیدها، طراحی شد و با انجام "واکنش زنجیره اي پلیمراز" به شناسایی ژن کدکننده سیکلوتیدها در گیاه "بنفشه معطر" ایرانی پرداخته شد. پس از بررسی اولیه محصولات واکنش زنجیره اي پلیمراز با ژل الکتروفورز، براي تایید نهایی، ژن ها توالی یابی شدند.
با بررسی توالی ژن هاي بدست آمده و انجام همترازي توالی هاي نوکلئوتیدي بومی با توالی هاي موجود در پایگاه داده GenBank به این نتیجه رسیدیم که دو ژن سیکلوتید گیاه بومی ایران به ترتیب %93 و %89 یکسانی با سایر توالی هاي کدکننده سیکلوتیدها دارند. همچنین، با بررسی محتواي cDNA این گیاه مشخص شد که از این دو ژن تنها یک ژن بیان می شود. نتایج تحقیقات ما نشان داد بنفشه معطر ایرانی با توجه به شرایط محیطی پرورش آن، داراي محتواي ژنی متفاوتی در مقایسه با گونه هاي مشابه در کشورهاي دیگر می باشد.
مقدمه:
سیکلوتیدها یک خانواده بزرگ از پروتئین هاي کوچک هستند که داراي 37 – 28 اسید آمینه و یک موتیف ساختاري به نام Cyclic Cystine Knot - CCK - می باشند.
این موتیف از 6 رزیدوي سیستئین حفاظت شده و 3 پیوند دي سولفیدي تشکیل شده است. وجود این موتیف سبب مقاومت و پایداري استثنایی سیکلوتیدها به حرارت، مواد شیمیایی و آنزیم ها شده است به گونه اي که فعالیت زیستی سیکلوتیدها حتی پس از جوشاندن و یا تیمار با عوامل شیمیایی کائوتروپ حفظ می شود.
سیکلوتیدها در حال حاضر بزرگترین خانواده شناخته شده پروتئین هاي حلقوي هستند و به صورت ریبوزومی سنتز می شوند. عملکرد طبیعی سیکلوتیدها در گیاهان - به عنوان ارگانیسم تولید کننده - دفاع علیه حشرات آفات و پاتوژن ها می باشد.
در میان این خانواده تنوع وسیعی از عملکرد هاي زیستی هم مشاهده شده است: همولیتیک، سیتوتوکسیک، ضد ویروس نقص ایمنی اکتسابی، ضد تومور، ضد باکتریایی و ... بخشی از این عملکردها می باشد.
سیکلوتیدها در خانواده هاي گیاهی بنفشیان، قهوه، کدو یافت شده اند:.
خانواده قهوه یک خانواده تقریبا بزرگی است که از 11000 گونه ساخته شده است. خانواده بنفشیان کوچکتر است و تقریبا 900 گونه دارد، تمامی گونه هایی از این خانواده که تا کنون بررسی شده اند، حاوي سیکلوتید می باشند اما در خانواده قهوه، %10-5 گونه هاي بررسی شده حاوي سیکلوتید هستند.
از طرفی تخمین زده اند که هر گیاهی به تنهایی می تواند بین 60 -15 سیکلوتید مختلف را بیان کند اما این تعداد با تغییر شرایط محیطی تغییر خواهد کرد. - - 3 ممکن است تعداد سیکلوتیدها در طبیعت به بیش از 9000 سیکلوتید متفاوت برسد. تنوع توالی سیکلوتیدها نه تنها بین گونه هاي یک خانواده، مشاهده شده بلکه شواهدي مبنی بر اینکه در یک گونه منحصر به فرد مجموعه متنوعی از سیکلوتیدها به صورت فصلی بیان می شوند، وجود دارد. - - 4 بنابراین بیان سیکلوتیدها بر مبناي شرایط محیطی نظیر: محل پرورش یا فصل رویش تغییر می کند.
در این پژوهش به بررسی توالی هاي نوکلئوتیدي و اسیدآمینه اي سیکلوتید موجود در این گونه پرداختیم. ایران یکی از مکان هایی است که گونه هاي متنوعی از خانواده بنفشیان را در خود جاي داده است و یکی از آنهابنفشه معطّرمی باشد. این گیاه در طب سنتی به عنوان یک داروي قابض در درمان برفک دهان، بیماریهاي پوستی و سیاه سرفه کاربرد داشته واز آن بعنوان ترکیب ضدمیکروبی استفاده فراوان شده است.
از طرف دیگر مطالعات انجام شده در ایران منحصر به بررسی فعالیت ضد میکروبی این گیاه بوده و هیچگونه تحقیقی در سطح مولکولی روي محتواي پپتیدي این گیاه صورت نگرفته است. در این پژوهش که در واقع بخش کوچکی از مطالعه ما در زمینه استفاده از پپتیدهاي ضد میکروبی در طراحی داروهاي جدید می باشد، به بررسی وجود ژن سیکلوتیدها در بنفشه پرداختیم. هدف از پژوهش حاضر دسترسی به تنوعی از توالی هاي سیکلوتیدها و بررسی اهمیت هر رزیدو در مکانیسم عملکرد آن و امکان تغییر در فعالیت ضد میکروبی این پپتیدها با تغییر در اسید آمینه هاي مهم به کمک ابزار بیوانفورماتیک و شبیه سازي می باشد.
مواد و روش ها:
جمع آوري و شناسایی گیاه بنفشه معطر: گیاه مذکور در نیمه روز اواسط فروردین ماه از پارك جنگلی شهداي غرب مازندران با طول جغرافیایی 5 درجه و 25 دقیقه و عرض 36 درجه و 39 دقیقه جمع آوري گردید. گیاهان جمع آوري شده در پژوهشکده گیاهان دارویی دانشگاه شهید بهشتی شناسایی و تایید شد که این گیاهان بنفشه معطر می باشد.
استخراج DNA ژنومی و تکثیر ژن مورد نظر: براي استخراج DNA ژنومی از برگ هاي گیاه مذکور از پروتوکل "DNA Isolation Methods For Medicinal and Aromatic Plant" استفاده شد. براي تعیین غلظت و خلوص نمونه هاي DNA، با استفاده از اسپکتروفوتومتر جذب نمونه در طول موج 260 و 280 نانومتر اندازه گیري شد. پرایمرهاي مورد استفاده در این واکنش بر اساس توالی هاي cDNA سیکلوتیدها که در GenBank موجود می باشد و با استفاده از نرم افزار Genrunner طراحی شدند.
جدول :1 خصوصیات پرایمرهاي مورد استفاده و طول قطعه مورد نظر.
برنامه واکنش زنجیره اي پلیمراز 30 چرخه به صورت زیر انجام شد: 95 ºC، 1 دقیقه؛ 60 ºC، 30 ثانیه؛ 72 ºC، 1 دقیقه. سپس محصولات واکنش زنجیره اي پلیمراز روي ژل آگاروز %1 بررسی شدند. سپس باندها را از روي ژل برش داده و با کیت QIAquick - Qiagen - از ژل خالص شدند و براي توالی یابی به شرکت ژن فن آوران فرستاده شدند.
استخراج RNA، تولید cDNA و بررسی بیان سیکلوتیدها: RNA تام سلولی از برگ هاي گیاه مذکور و با استفاده از RNAquos Midi kit انجام شد. همانند DNA ژنومی خلوص و مقدار RNA با اندازه گیري نسبت جذب 260 /280 تعیین شد. سپس واکنش ریورس ترنسکریپتاسیون با استفاده از Expand Reverse Transcriptase - Roche - انجام شد. برنامه واکنش زنجیره اي پلیمراز نیز مطابق برنامه فوق انجام شد.
بررسی توالی هاي نوکلئوتیدي با نرم افزارهاي chromas و : Generunner توالی هاي نوکلئوتیدي با برنامه Chromas، آنالیز و با برنامه Genrunner به توالی اسیدآمینه اي ترجمه شد. سپس این توالی هاي نوکلئوتیدي و پپتیدي به ترتیب با برنامه BlastN و BlastP با توالی هاي موجود در GenBank همترازي شد.
نتایج و بحث:
استخراج DNA ژنومی و انجام واکنش زنجیره اي پلیمراز: میزان خلوصDNA ژنومی جذب 1.8 =260 /280 بود. یعنی خلوص نمونه DNA مناسب است. اگر مقدار این نسبت کمتر از 1.8 باشد، بدین معناست که در نمونه DNA آلودگی پروتئینی وجود دارد و اگر بیشتر باشد آلودگی RNA در نمونه DNA وجود دارد. شکل –1 - الف - مشخص می کند که DNA ژنومی استخراج شده سالم و بدون شکستگی می باشد زیرا در ژل اسمیر مشاهده نمی شود. با استفاده از جفت پرایمرهاي A و B واکنش زنجیره اي پلیمراز انجام شد و قطعاتی با اندازه 570 و 476 جفت باز با این پرایمر ها تکثیر شدند.
شکل :1 تصویر ژل الکتروفورز الف - سنجش کیفیت DNA استخراج شده از برگ هاي گیاهبنفشه معطّر.ب - تایید محصولات واکنش زنجیره اي پلیمراز. شماره 1 و 2 به ترتیب مربوط به قطعه تکثیر شده با جفت پرایمرهاي A و B می باشد. :S.M مارکر وزن مولکولی.
استخراج RNA تام سلولی و بررسی بیان سیکلوتیدها: کیفیت RNA استخراج شده با انجام ژل الکتروفورز تایید گردید. - شکل - 2 با انجام RT-PCR مشخص شد که از بین دو ژن A و B تنها ژن B بیان می شود. علت هاي متفاوتی می توان براي عدم بیان ژن A ذکر کرد: ممکن است در آن بافت خاص، بیان نشده باشد و در سایر بافت ها بیان شده باشد. ممکن است در آن زمان خاص که برگ از گیاه جدا شد رونویسی از این ژن صورت نگرفته باشد و کمی بعدتر زمان تولید آن فرا می رسید. ممکن است گیاه در شرایطی بوده باشد که محصول ابن ژن در آن فصل خاص مورد نیاز نبوده است.
شکل ٢: ژل الکتروفورز .RT-PCR ستون١: ژن B، ستون٢: ژن A، که ژن A
بررسی توالی هاي نوکلئوتیدي و پپتیدي: توالی نوکلئوتیدي تکثیر شده توسط جفت پرایمرهاي A و B و نیز توالی پپتیدي پیشگویی شده آنها در شکل 3 آمده است. نتایج همترازي این توالی ها با توالی هاي سیکلوتیدي موجود در پایگاه داده هاي توالی نشان داد - شکل - 4 که میزان یکسانی توالی A با توالی ژن Voc1، %93 می باشد
