بخشی از مقاله
چکیده
کلسی تونین یک هورمون پلی پپتیدي است که در متابولیسم کلسیم و فسفر نقش محوري ایفا می کند این ترکیب امروزه بعنوان دارو در درمان بیماریهاي استخوان از قبیل پوکی، شکستگی و ... کاربرد روز افزونی یافته است. تلاش هاي گسترده اي براي تولید کلسی تونین نوترکیب انسانی در جریان است که در این راستا شناسایی کیفی و کمی کلسی تونین نوترکیب بیان شده در میزبان هاي مختلف از اهمیت ویژه اي برخوردار است.
از بین روشهاي مختلف شناسایی و تعیین درجه خلوص نمونه کلسی تونین، روشهاي کروماتوگرافی و اسپکتروسکوپی از جایگاه ویژه اي برخوردارند که در این تحقیق نمونه کلسی تونین نوترکیب انسانی تولید شده توسط روشهاي 1UV/VIS، 2FTIR و 3HPLC شناسایی و مورد ارزیابی کمی قرار گرفته است. روشهاي بکار رفته در شناسایی و تعیین درجه خلوص کلسی تونین داراي سرعت، دقت و گزینش پذیري بیشتر و همچنین هزینه کمتر نسبت به سایر روشهاي معمول نظیر Biological Assay می باشند.
مقدمه
کلسی تونین که اولین بار توسط کوپ و همکارانش کشف گردید یک هورمون پلی پپتیدي با 32 اسید آمینه است که در متابولیسم کلسیم و فسفر نقش محوري ایفا می کند و تنظیم کننده داخلی هموستازي کلسیم است. کاربرد متداول کلسی تونین که توسط FDA نیز تائید شده در درمان پوکی استخوان در دوران یائسگی است که به همراه مقادیر مناسب ویتامین D و کلسیم از حالت پیشرونده این بیماري جلوگیري می کند. این دارو در درمان دردهاي استخوان ناشی از تئوپلاسم و متاستاز نیز نقش مهمی دارد. تمام انواع کلسی تونین از قطعات متنوع اسیدهاي آمینه تشکیل شده اند که تفاوت آنها در ترتیب توالی اسیدهاي آمینه شان می باشد. ساختار بعضی از کلسی تونین ها در شکل 1 آورده شده است
شکل-1 توالی پپتیدها در انواع کلسی تونین
کلسی تونین طبیعی خوك، ماهی سالمون و آنالوگ هاي کلسی تونین مارماهی انواع مختلف هورمون می باشند که بعنوان دارو مورد استفاده قرار می گیرند بطوریکه کلسی تونین سالمون و خوك در فارماکوپ دارویی انگلستان و اروپا بعنوان ماده دارویی گزارش شده است. امروزه بخاطر مزیت هاي فراوان کلسی تونین نوع انسانی نسبت به سایر کلسی تونین هاي موجود تحقیقات وسیعی در تولید و تخلیص و معرفی آن بعنوان داروي جایگزین در حال انجام است. در این تحقیق نسبت به شناسایی کیفی و کمی کلسی تونین انسانی تولید شده اقدام شده است. ساختار سه بعدي کلسی تونین انسانی در شکل 2 نشان داده شده است
شکل-2 ساختار سه بعدي کلسی تونین انسانی
مواد و روشها: کلیه مواد شیمیایی مورد استفاده به غیر از کلسی تونین انسانی استاندارد که از شرکت سیکما تهیه گردید از شرکت مرك آلمان تهیه گردیدند. مدل دستگاه HPLC مورد استفاده Knauer می باشد همچنین مدل اسپکتروفتومترهاي ماوراي بنفش UV/VIS و FTIR مورد استفاده بترتیب Jasco - V570 - و Perkin Elmer - Spectrum One - می باشند.
آنالیزکیفی: از بین روشهاي مختلف شناسایی و تعیین کمی کلسی تونین نظیر آنالیز اسیدهاي آمینه, شناسایی نقشه پپتیدي, روشهاي کروماتوگرافی و غیره در این تحقیق از روشهاي کروماتوگرافی واسپکتروسکوپی بهره گرفته شد. از جمله روشهاي حساس و دقیق براي شناسایی ترکیبات مختلف، استفاده از طیف FTIR و UV/VIS این ترکیبات می باشد. محلول متانولی از نمونه کلسی تونین نوترکیب تهیه گردید و از نمونه فوق طیف UV/VIS گرفته شد - شکل - 3 همچنین از نمونه جامد نیز طیف FTIR - قرص برمید پتاسیم - تهیه گردید - شکل. - 4 با مقایسه طیف هاي ذکر شده با طیفهاي کلسی تونین انسانی موجود در مراجع استاندارد، ساختار شیمیایی کلسی تونین نوترکیب تولید شده مورد تائید قرار گرفته است.
شکل-3 - سمت راست - : طیف UV/VIS کلسی تونین استاندارد انسانی، - سمت چپ - : طیف UV/VIS کلسی تونین انسانی نوترکیب تولید شده
همانطور که در شکل 3 سمت راست مشاهده می شود کلسی تونین انسانی استاندارد در ناحیه 278 نانومتر داراي جذب ماکزیمم است که جذب مشابهی براي نمونه تولید شده نیز در شکل 3 سمت چپ مشاهده می گردد. همچنین تشابه ساختاري طیفی بسیار نزدیکی بین دو نمونه وجود دارد. از مقایسه طیف هاي FTIR دو نمونه - شکل - 4 در عدد هاي موجی مربوط به گروههاي عاملی آمینی، کربونیل، اسیدي می توان به تشابه ساختاري آنها پی برد که مبین یکسان بودن دو نمونه می باشد - اختلاف اندك مشاهده شده در طیف ها بیانگر حضور ناخالصی و همچنین رقت نمونه نوترکیب تولید شده می باشد - .
شکل-4 - سمت راست - : طیف IR کلسی تونین استاندارد انسانی، - سمت چپ - : طیف FTIR کلسی تونین انسانی نوترکیب تولید شده
از مقایسه طیف هاي UV/VIS و FTIR نمونه هاي کلسی تونین استاندارد و نوترکیب چنین بر می آید که دو نمونه از نظر ساختار شیمیایی یکسان می باشند.
آنالیز کمی: جهت تعیین کمی کلسی تونین انسانی تولید شده توسط HPLC ابتدا از روش - 3 - Ishikawa بهره گرفته شده بود که با توجه به مشکلات این روش - عدم تکرارپذیري و ... - ترجیح داده شد از روش معتبر ذکر شده در فارماکوپ استفاده شود
