بخشی از مقاله
چکیده - میکروسکوپ فلورسانس بازتاب داخلی کلی به دلیل کاربرد در تصویربرداری از سطح با ضخامت حدود 100-200 نانومتر روشی مناسب برای بررسی فرایندهای سلولی، بهویژه در نزدیکی غشای سلول زنده، است. در این پژوهش، یک میکروسکوپ فلورسانس بازتاب داخلی کلی بر پایه منشور طراحی شده است. به منظور بهینهسازی چیدمان آزمایشگاهی، از یک باریکهگستر برای موازی سازی و گسترده نمودن سطح نوردهی به نمونه، و از روغن شناوری نیز بهعنوان لایه میانی استفاده شده تا اتلاف ناشی از پراکندگی و جذب نور ضمن عبور از محیطهای با ضریب شکست متفاوت کاهش یابد.
1 مقدمه
میکروسکوپی فلورسانس بازتاب داخلی کلی نخستین بار توسط دانیل آکسلرد در سال 1980 مطرح گردید .[1] در این روش، از موج میرای ناشی از بازتاب داخلی کلی منبع نور برای برانگیزش مولکولهای فامساز در فاصلهی حدود 100 تا 200 نانومتر از سطح استفاده میشود .[2] به منظور بهینهسازی تصویربرداری، چیدمانهای مختلفی برای این روش ارائه شده است .[3] امروزه از میکروسکوپهای مستقیم و وارون برای میکروسکوپ فلورسانس بازتاب داخلی کلی استفاده میشود. با انتخاب نوع میکروسکوپ به منظور هدایت پرتو به سمت نمونه و فراهم نمودن شرایط مناسب بازتاب داخلی کلی، از منشور یا موجبر و یا عدسی با روزنهی عددی بالا میتوان استفاده نمود.
برای استفاده از این نوع میکروسکوپ سه نکته مهم باید در نظر گرفته شود: -1 نور تابشی بیشتر سطح نمونه را در برگیرد، -2 شدت نور تابشی و قطبش آن که از مولفههای با اهمیت برای برانگیزش مولکولهای فامساز به شمار میآید، تحت کنترل باشد [4] و -3 پراکندگی و جذب ناخواسته نور در اثر تغییر ناگهانی ضریب شکست محیطهایی که نور از آن عبور میکند به حداقل برسد .[5]
قرار دادن باریکه گسترده نور در چیدمان برای رساندن نور به سطح بیشتری از نمونه، استفاده از مجموعهای از قطبشگرها جهت کنترل شدت و قطبش نور، قرار دادن لایهای میانی بین منشور - عامل بازتاب داخلی - و سطح زیرین نمونه جهت کاهش میزان پراکندگی و جذب نور از جمله راهکارهایی است که میتواند میکروسکوپ فلورسانس بازتاب داخلی کلی را بهینه نماید تا بهعنوان گزینه مناسبی برای مشاهده سطح نمونهها از جمله سلول-های زنده در زمینه بیوفیزیک در نظر گرفته شود. در این مقاله، یک میکروسکوپ مستقیم بر پایه منشور طراحی و راهاندازی شده و از نمونههای رودامین - Rd6G - تصویربرداری شده است.
-2 چیدمان تجربی
مطابق شکل 1، چیدمان آزمایشگاهی از یک منبع نوری، منشور، میکروسکوپ نوری و آشکارساز سی سی دی شکل :1 چیدمان میکروسکوپ فلورسانس بازتاب داخلی کلی بر پایه منشور شامل 1 - و - 2 قطبشگر، - 3 - مجموعه پهن کننده باریکه، - 4 - آینه و - 5 - مجموعه میکروسکوپ و منشور. تشکیل یافته و برای بهینهسازی آن ابزارهای اپتیکی مختلفی به کار گرفته شده است.
لیزر رایجترین منبع نوری مورد استفاده در اینگونه چیدمان-ها است که با توجه به مواد فامساز موجود در نمونه انتخاب میشود، در این چیدمان دو لیزر سبز پیوسته نئودیمیوم یاگ - 532 nm - با توان اسمی 100 mw و لیزر دیودی قرمز - 635 nm - با توان اسمی 20 mw مدل dpss کشور چین به کار گرفته شدهاند. برای کنترل شدت نور لیزر و قطبیدگی آن مجموعه دو قطبشگر به کار گرفته شده است که یکی بهعنوان قطبشگر و دیگری بهعنوان تحلیلگر به کار میرود.
با تغییر زاویه محور قطبش قطبشگر میزان عبور نور تغییر نموده و با تغییر زاویه محور قطبش تحلیلگر این میزان کم و زیاد میشود و بدین ترتیب میزان شدت قابل کنترل خواهد بود. از آنجاکه هدف در این روش، تصویربرداری از سطح نمونه سلولی است، نیاز به پرتوی پهن و موازی برای روشن ساختن کل سطح مورد مطالعه احساس میشود. بدینجهت از پهنکننده باریکه شامل دو عدسی با فاصله کانونیهای متناسب استفاده شده است.
پرتو نور با کمک یک آینه تحت زاویهای مناسب، که باید بزرگتر از زاویه حد باشد تا بازتاب داخلی رخ دهد، به سمت منشور تعبیه شده در میکروسکوپ هدایت شده است. منشور عنصر اساسی این چیدمان بوده و با ایجاد بازتاب داخلی کلی و تولید موج میرا کار روشن سازی نمونه را انجام میدهد. نور با عبور از منشوری از جنس BK7 - محیطی با ضریب شکست - 1/518 وارد هوای موجود بین منشور و تیغه شیشهای نازک زیر نمونه - محیط با ضریب شکست کمتر - میشود.
این عبور باعث رخ دادن پدیدههای نامطلوب پراکندگی و جذب نور، به دلیل تغییر ناگهانی ضریب شکست محیط، میشود. بدینجهت احتیاج به لایهای میانی است که ضریب شکست آن برابر ضریب شکست منشور باشد تا با ورود نور به آن لایه، اتلافی رخ ندهد. در این چیدمان از روغن شناوری مخصوص میکروسکوپ با ضریب شکست 1/518 استفاده شده است .[6] دادههای حاصل از این چیدمان، به منظور تهیهی تصویر مناسب برای تحلیل پدیدههای نزدیک به غشای سلولی، گزارش و رفتار توان لیزر در هر مرحله عبور از اجزای چیدمان شامل قطبشگر، تحلیلگر، منشور، روغن شناوری و تیغه شیشهای نازک به کمک توانسنج مورد بررسی دقیق قرار گرفته است.
-3 نتایج و بحث
با توجه به اهمیت پایداری توان لیزر تابشی در آزمایش، در اولین مرحله به بررسی پایداری توان لیزر در زمانها و فاصلههای مختلف پرداخته شده است بدینجهت تغییر توان لیزرهای با طول موج 532 نانومتر - سبز رنگ - و 635 نانومتر - قرمز رنگ - در فاصلههای زمانی 5 min و در فاصلههای مکانی 20 cm مورد بررسی قرار گرفته و در شکل 2 نمودار میانگین زمانی آنها رسم شده است. همانطور که در شکل مشاهده میشود توان لیزرها تغییر چندانی با گذشت زمان و در فاصلههای مختلف نکرده است و این نشان از پایداری لیزر در یک بازه زمانی و مکانی مشخص دارد.
مختلف محور قطبش اندازهگیری شده است. با توجه به شکل رفتار منظمی در عبور نور مشاهده میشود. در زاویههای متعامد عبور صفر و در زاویههای یکسان عبور بیشینه به خوبی مشهود است. با کمک این دو نمودار به خوبی میتوان محور قطبیدگی قطبشگر و تحلیلگر را برای دستیابی به شدت نور مطلوب تنظیم نمود. نمونههای زیستی بسیار آسیبپذیر و حساسند در نتیجه میزان شدت نور تابشی به آنها باید کنترل شده و مناسب باشد که با استفاده از این نمودار میتوان به آن دست یافت.
