بخشی از مقاله
چکیده:
سرطان کلون یکی از سرطانهاي شایع میباشد. ژن درمانی به عنوان یکی از راههاي درمانی در جهان مطرح است. مسیر سیگنالینگ Wnt بطور فزاینده اي در سرطان کولون - - CRC فعال است. ساخت سازه اي که در صورت فعال بودن این مسیر، بتواند موجب بیان ژن گزارشگر شود می تواند ما را در مسیر ژن درمانی کمک کند. پس از بررسیهاي داده هاي ریز آرایه اي؛ ژن - Neural cell adhesion Molecule - Nr-cam - براي ژنهایی که داراي بیان افزایش یافته اي در سلولهایی هستند که این مسیر در آنها فعال است - برگزیده و بهترین ناحیه پروموتوري آن حاوي TATA box در فاصله -25 bp همراه با 4 محل LEF1/TCF Binding Sequences در Nr-cam انتخاب شد.
پروموتر ژن Nr-cam پس از PCR درون ناقل T VECTOR pTZ57R/T کلون شد. بعد از تعیین توالی ، پروموتر ژن Nr-cam ، در بالادست ژن گزارشگر LacZ در پلاسمید pUC-LacZ کلون شد ، تا پلاسمید pUC-Nrcam-LacZ به عنوان سازه Reporter مسیر Wnt در سرطان کولون به دست آید.از این سازه می توان به عنوان سازه گزارشگر بیانی ویژه سرطان کولون سود جست ، بطوریکه ژن گزارشگر هرگز در بافتهاي نرمال بیان ندارد .هدف آینده ما استفاده از این سازه به عنوان سیستم گزارشگر ویژه،جهت آماده سازي راهی براي ژن درمانی سرطان کولون و بررسی فعالیت این مسیر در سلول هاي مختلف می باشد.
مقدمه:
چهارمین سرطان مرگ آور در ایران سرطان کولون - 1 - CRC می باشد . شیوع مرگ آوري این سرطان در آمریکا و کشورهاي غربی طبق بررسی هاي انجام شده در سال 2002 میلادي از یک میلیون و دویست هزار مورد بیماري منجر به مرگ 529 هزار نفر شده است. بزرگترین عامل خطر این سرطان رژیم غذایی غربی است. پولیپهاي آدنومایی از سلولهاي اپی تلیال هنجار کولون با تجمع جهش هایی در ژنهاي مهار کننده تومور همچون APC و P53 و SMAD4 بوجود می آید.
مسیر سیگنالینگ :WNT
مهمترین عامل ایجاد سرطان کولون مربوط بهWingless/Wnt gene - Wg/Wnt - signal transduction Pathway می باشد.
چنانچه در سلولهاي نرمال و غیر سرطانی، Wnt؛ پروتئین 2fzl را تحریک کرده و با این کار پروتئینهاي 3Dsh و 4GSK3β را فعال می کند ، همین امر باعث می شود که β-catenin به عنوان یکی از پروتئین هاي اتصال سلولی، توسط کمپلکس پروتئینهایی همچون 5APCوGSK3β در انتهاي N خود فسفریله شده،با ubiquitin ها بسوي degradation هدف گزاري شده و توسط پروتئازوم از بین برود
APC ژن مهار کننده توموري می باشد، که غیر فعال شدنش نخستین رویداد در تومور زایی در بافت کولون است. لذا اگر در هر کدام از اعضاي Complex Dsh/GSK3β/APC جهشی وجود داشته باشد،این مسیر متوقف شده وβ-catenin ها درسیتو پلاسم تجمع یافته و به هسته سلولی منتقل شده و با 6TCF/LEF که خانواده اي از عوامل رونویسی می باشد، متصل شده و فعال سازي رونویسی ژنهاي مربوط به رشد و تکثیر و سرطانزایی - وابسته به - LEF1/TCFرا برمی انگیزد.
بطوریکه در سال 2002 ایکنوئه و همکارانش نشان دادند که مسیر سیگنالینگ β-catenin/TCF در %100 سرطانهاي کولورکتال و %68 سرطانهاي معده فعال است. β-catenin - 6 - در حقیقت در سرطان کولون داراي نقش کلیدي بوده واز راههاي مختلفی می تواند در تومور زایی نقش داشته باشد. در مطالعه اي که ائوکی و همکارانش انجام دادند، نشان دادند که علت اصلی سرطانهایی که جهشی در ژن APC یا β-catenin دارند؛ ناهنجاري در رونویسی از ژنهاي عوامل اتصالی LEF1/TCF می باشد - LEF1 . - 7 خود به خانواده اي از عوامل رو نویسی تعلق دارد، که همگی یک قسمت مشترك DNA را شناسایی می کنند.
ژنهاي پایین دست مسیر سیگنالینگ Wnt با تکنیکهاي همچون Microarray در حال شناسایی هستند. نمونه اي از این ژنها که در سلولهاي سرطانی کولون CRC نسبت به بافتهاي نرمال افزایش بیان دارندعبارتند از: 7HATH1 و 8AF17 و 9WISP و 10BMP4 و .CYCLIN D1 یکی از این ژنها که مارالیس و همکارانش شناسایی کرده اند، ژن 11Nr-CAM می باشد که به عنوان یکی از مسیرهاي پایین دستی سیگنالینگ Wnt معرفی شده است و در ملانوسیت ها و بافت کولون نرمال بیان ندارد، اما در سلولهاي سرطانی کولون به میزان 70 برابر بیان می گردد.بررسی پروموتر این ژن بیانگر وجود جعبه TATA در 25 باز بالا دست محل شروع رونویسی و 4 محل LEF1/TCF Binding Sequences در ناحیه پروموتري و اولین اینترون این ژن می باشد
مواد و روشها:
مواد: مواد و آنزیمهاي محدود کننده و پرایمر ها از شرکت سیناژن/ایران و کیت استخراج محصول PCR از شرکت فرمنتاس و کیت Gel Extraction DNA از شرکت کیاژن و کیت تخلیص پلازمید از شرکت Core Bio تهیه گردید.
ترادف پرایمرهاي اختصاصی :Nr-cam
پرایمر فرادست: 5'AAGCTTAACACACAGAGACATGATCGTACAAC3'
پرایمر فرودست: 5'AAGCTTAAATGAGTGTTCAGAGGCTATCGTGTC3'
جهت کار بر روي پروموتر ژن Nr-cam ابتدا DNA ژنومی انسانی را از خون محیطی بر اساس با روش - 9 - Salting out استخراج کرده و سپس با استفاده از پرایمر هاي اختصاصی Nr-cam، واکنش PCR انجام شد و در ادامه نیز این ژن در ناقل T VECTOR همسانه سازي گردید.سپس تخلیص پلاسمیدها نیز بر اساس روش ستونهاي سیلیکایی انجام شد.
نتایج و بحث:
محصول PCR پروموتر ژن Nr-cam - شکل الف ردیف - 1 به طول 1442 bp را درون T VECTOR،pTZ57R/T
- شرکت فرمنتاس/لیتوانی - کلون کرده و پس از تعیین توالی مشخص شد که در پروموتر ژن Nr-cam ؛ هیچ گونه موتاسیونی نداشتیم.
با استفاده از آنزیم HindIII پلاسمید - 11 - pUC- LacZ را خطی کرده و پروموتر ژن Nr-cam را در آن کلون کرده و پلاسمید pUC-Nrcam- LacZ را ساختیم.
پس از کلونی PCR براي غربالگري آن؛ عمل هضم بر روي پلاسمید pUC-Nrcam-LacZ - شکل - 2با استفاده از آنزیم - HindIII شرکت سیناژن/ایران - ،جهت جدا کردن پروموتر ژن Nr-cam و اثبات کلونینگ این پروموتور در وکتور مربوطه انجام شد.
پلاسمید گزارشگر pUC-Nrcam-LacZ جهت ارزیابی بیان ژن گزارشگر بوسیله این پروموتور در رده هاي سلولی مختلف از جمله کولون می تواند مورد استفاده قرار گیرد. بدلیل بیان بالاي ژن Nr-cam و به پیروي از فعال بودن پروموتور آن در سلولهاي سرطانی کولون به میزان 30-70 برابر نسبت به بافت هاي نرمال، بیان ژن گزارشگر LacZ در سلولهاي سرطانی؛ بسیار افزایش می یابد و می تواند علاوه بر بیان ویژگی یافته در سلولهاي سرطانی، در آنها بیان بسیار بالایی هم داشته باشد.
هدف آینده ما بررسی میزان و الگوي بیان این سازه گزارشگر در یاخته هاي نرمال و سرطانی بویژه کولون می باشد، تا از بیان ویژگی یافته آن در سلولهاي سرطانی مطمئن شویم و همچنین یکی از ژنهاي پایین دست این مسیر را از نظر بیان در یاخته هاي دیگر سرطانی مورد بررسی قرار دهیم و در حقیقت با این کار مسیر سیگنالینگ Wnt را در یاخته هاي دیگر از نظر فعالیت مورد مطالعه قرار دهیم.
شکل الف: ردیف - 1 محصول PCR پروموتر ژن Nr-cam به طول 1442 bp ردیف Marker 1Kb - 2
شکل ب: ردیف - 1 محصولDigestion روي پلاسمید pUC- Nrcam- LacZ با آنزیم HindIII و ایجاد قطعات پروموتر ژن Nr-cam به طول 1442 bp و pUC – LacZ به طول 4700 bp ردیفMarker 1Kb - 2
