بخشی از مقاله
چکیده
گلومالین یک ترکیب گلیکوپروتئینی ویژه است که توسط قارچهای راسته گلومرال از رده گلومرومایکوتا تولید شده و با کاهش قابلیت دسترسی فلزات سنگین به ریشه گیاه نقش اصلی را در غیر متحرکسازی آنها در خاک ایفا میکند. در این تحقیق، میزان تولید گلومالین و مقدار سرب غیرمتحرک شده با این گلیکوپروتئین در گیاه آفتابگردان - هیبرید فرخ - تلقیح شده با قارچ Rhizophagus irregularis بررسی شد.
سه سطح سرب شامل صفر - Pb0 - ، - Pb1 - 500 و 1000 - Pb2 - میلیگرم سرب بر کیلوگرم از منبع نیترات سرب به خاک اضافه شد. نتایج نشان داد که با افزایش غلظت سرب خاک، مقدار TGR به طور معنیداری کاهش یافت، به طوری که در سطوح Pb1 و Pb2 به ترتیب 28/91 و 38/77 درصد کاهش نسبت به تیمار شاهد بدون سرب مشاهده گردید. مقدار سرب غیرمتحرک شده توسط TGR در سطوح Pb1 و Pb2 در تیمارهای میکوریزی به ترتیب 4/034 و 4/614 میلیگرم بر گرم گلومالین ریشه بود.
مقدمه
کشت گیاه و تولید محصول در خاکهای آلوده به فلزات سنگین همواره این نگرانی را به دنبال داشته است که این عناصر از طریق ریشه جذب شده و به بخش هوایی منتقل شوند و به دنبال آن، با تغذیه انسان و دام از بخش هوایی، خسارات جبران ناپذیری وارد میشود. روشهای مختلف برای ممانعت از حرکت این عناصر سمی از خاک یا ریشه به قسمت هوایی گیاه به کار گرفته شده است. در این میان استفاده از برخی میکروارگانیسمها و به ویژه انواع همزیست چشمانداز خوبی ارائه کرده است.
همزیستی ریشه با قارچهای میکوریزی گاهی سبب تحرک بیشتر فلزات سنگین و انتقال آنها به بخش هوایی شده است ولی در برخی موارد، قارچ با غیرمتحرک کردن فلزات سمی در خاک مانع از ورود آنها به ریشه شده و یا این که با غیرمتحرک کردن آنها در داخل ریشه، مانع از حرکت آنها به بخش هوایی میشوند. در این رابطه به نظر میرسد یکی از مکانیسمهای مهم، غیرمتحرک شدن یون فلز در خاک یا ریشه باشد
قارچهای میکوریز آربوسکولار از راسته گلومرال1 با 70 درصد گیاهان همزیستی تشکیل میدهند . - Biro and Takacs 2007 - این قارچها در همزیستی گسترده با ریشه گیاهان، با تأمین عناصر معدنی و تعدیل تنشهای محیطی، رشد آنها را بهبود میبخشند و نقش کلیدی و مهمی در تسهیل جذب مواد غذایی در اکوسیستمهای مختلف، به ویژه در سیستمهای کشاورزی با ورودی کم، بازی میکنند
گلومالین گلیکوپروتئین تولید شده به وسیله هیفهای قارچهای AM2 میباشد که مقاوم به تجزیه بوده و میتواند مقادیر بالایی از کربن و نیتروژن را ترسیب کند - Nichols and Wright 2006 - ، لذا میتوان نتیجه گرفت که جریان کربن از این مسیر، عمدتاً به شکل گلومالین در خاک پدیدار میگردد - Purin and Rillig 2008 - ، یعنی قارچ از کربن گیاه برای رشد خود و تولید گلومالین استفاده میکند
این گلیکوپروتئین روی هیف و اسپور قارچهای گلومرال، ریشههای کلونیزه شده، مواد آلی، ذرات خاک و آربوسکولهای داخل سلولهای ریشه قرار میگیرد . - Wright 2000 - هنگامی که هیف قارچ تجزیه میشود، گلومالین در خاک آزاد میگردد . - Treseder and Allen 2000 - بنابراین میزان هیفهای پایدار، مقادیر گلومالین در هیف و سرعت تجزیه هیف تعیین کننده میزان گلومالین آزاد شده در خاک خواهد بود. این پروتئین قارچی گاهی تا 27 درصد کربن آلی خاک را تشکیل میدهد. وزن مولکولی آن 2-24 برابر بیشتر از اسید هومیک بوده و به مدت 7-42 سال در خاک پایدار است. آلودگی خاک با فلزات سنگین یکی از مشکلات زیست محیطی عمده در جوامع بشری است که علاوه بر کاهش عملکرد و کیفیت محصول، پایداری تولیدات کشاورزی را دچار مخاطره نموده و سلامتی موجودات زنده را به خطر میاندازد. قارچ می تواند تحت تأثیر فلزات سنگین قرار گرفته و به این ترتیب کلونیزاسیون قارچهای AM کاهش مییابد
با توجه به تأثیرات منفی سرب بر همزیستی میکوریزی، تصور میرود که با افزایش سطوح سرب در خاک، میزان همزیستی قارچهای گلومرال کاهش یافته و جریان کربن آلی از بخش فتوسنتزی به ریشه کم شده و ترشحات گلومالین تقلیل یابد. هدف از این تحقیق بررسی تأثیر سطوح مختلف سرب بر تولید گلومالین قارچ Rhizophagus irregularis و میزان سرب کمپلکس شده توسط گلومالین تولید شده از قارچ R. irregularis همزیست با گیاه آفتابگردان و نیز مقدار سرب تجمع یافته در ریشه آفتابگردان میباشد.
مواد و روشها
زادمایه قارچی R. irregularis - اخذ شده از دپارتمان اکولوژی میکروبی دانشگاه لوند سوئد - 3 به شکل کشت درون شیشهای از آزمایشگاه بیولوژی خاک دانشگاه تبریز دریافت شد. خاک مورد نظر از ایستگاه تحقیقات کشاورزی دانشگاه تبریز نمونهبرداری شد. بعد از هوا خشک کردن و عبور از غربال دو میلیمتری، برخی از ویژگیهای تعیین گردید - جدول . - 1 خاک مورد نظر به منظور کشت گیاه، پس از عبور از غربال چهار میلیمتری به مدت دو ساعت در دمای 121 درجه سلسیوس و فشار 1/5 بار در اتوکلاو استریل شد. سطوح سرب شامل سه سطح صفر، 500 و 1000 میلیگرم سرب بر کیلوگرم خاک استریل و از منبع Pb - NO3 - 2 اعمال گردید
برای ایجاد سطوح سرب 36 کیلوگرم خاک استریل شده به سه قسمت تقسیم شده و به جز تیمار بدون سرب - شاهد - ، در هر تیمار 12 کیلوگرم خاک استریل شده بر روی صفحات پلاستیکی ضدعفونی شده پخش و مقدار نمک نیترات سرب لازم را در مقدار مشخصی آب مقطر برای رسیدن به رطوبت 0/8 FC حل کرده و به طور یکنواخت به خاک اسپری شد و ضمن اسپری به طور مرتب با بیلچه استریل به هم زده شد تا مخلوط یکنواخت و یک دستی حاصل شد و برای رسیدن به حالت تعادل بین فاز جامد و مایع به مدت 15 روز در همین حال - با حفظ رطوبت - 0/8 FC نگهداری شد. با توجه به غلظتهای مختلف نیترات سرب به کار رفته، جهت یکسانسازی اثر نیترات، از نمک نیترات سدیم - NaNO3 - استفاده شد.
از بذر آفتابگردان - Helianthus annuus L. - رقم تجاری هیبرید فرخ استفاده شد. بذور به مدت دو ساعت در آب مقطر خیس و سپس در هیپوکلریت سدیم 0/5 درصد به مدت 15 دقیقه ضدعفونی سطحی شدند. دو کیلوگرم خاک استریل - حاوی سطوح سرب - در هر گلدان ریخته شد و زادمایه قارچی - به شکل ژلهای، مخلوط شده با 70 گرم ماسه شسته استریل - در پنج سانتیمتری از سطح گلدانها قرار داده شد سپس توسط اسپاتول در سطح خاک گلدان، شیاری به عمق حدوداً سه برابر عرض بذر ایجاد کرده و بذر در آن قرار گرفت.
در مورد گیاهان شاهد غیرمیکوریزی، به همان مقدار محیط کشت فاقد قارچ مخلوط شده با ماسه شسته استریل اضافه گردید. عناصر غذایی نیتروژن 150 mg kg-1 - از منبع اوره - و پتاسیم - mg 100 kg-1 از منبع سولفاتپتاسیم - بر اساس نتایج آزمون خاک و توصیه کودی منطقه برای گیاه آفتابگردان، به طور یکنواخت به خاک همه گلدانها قبل از کشت افزوده و به خوبی مخلوط شد - ملکوتی . - 1379 رطوبت گلدانها به روش توزین در 0/8 FC تا 0/9FC تنظیم شد. گیاهان در آستانه مرحله گلدهی برداشت شدند.
برای استخراج گلومالین کل از محلول سیترات سدیم 50 میلیمولار استفاده شد. برای این منظور 14/705 گرم تریسدیم سیترات دیهیدرات - جرم مولکولی 294/10 گرم بر مول - را در 800 میلیلیتر آب مقطر حل کرده و pH آن با محلول اسید کلریدریک 0/1 نرمال روی 8 تنظیم و با آب مقطر به حجم یک لیتر رسانده شد. 8 میلیلیتر از این محلول بر روی یک گرم از ریشه تازه را که در فریزر - دمای -22 درجه سلسیوس - نگه داری شده بود اضافه شده و پس از 30 ثانیه ورتکس، به مدت 60 دقیقه در دمای 121 درجه سلسیوس اتوکلاو شد. سپس در 5000 دور در دقیقه، به مدت 15 دقیقه سانتریفوژ شد. محلول صاف بالایی جمع آوری شد و در لوله تمیز ریخته شد و در یخچال با دمای 4 درجه سلسیوس نگه داری شد
پس از برداشت 200 میکرولیتر، به باقیمانده عصاره حاوی گلومالین گرفته شده از ریشه، قطره قطره و با دقت، اسید کلریدریک 1 نرمال اضافه کرده به طوری که با افت pH به حدود 2/5، گلومالین به شکل رسوب در آمد؛ گلومالین رسوب یافته را پس از سانتریفوژ - در 5000 دور در دقیقه، به مدت 20 دقیقه - ، جدا کرده و سپس برای اندازهگیری سرب متصل به آن، یک میلیلیتر اسید نیتریک غلیظ 67 - درصد - اضافه کرده و به مدت 3-6 ساعت در بنماری - دمای 110 درجه سلسیوس - قرار داده شد. به این ترتیب با محو شدن رسوب گلومالین و زلال شدن محلول، از هضم کامل رسوب اطمینان حاصل گردید.
در نهایت غلظت سرب با دستگاه جذب اتمی قرائت شد. نمونهها بعد از خشک شدن، خرد شده و برای ایجاد نمونهای یکنواخت از الک 0/5 میلیمتری عبور داده شدند. برای اندازهگیری فسفر ، هضم نمونههای گیاهی به روش ترسوزانی انجام گرفت . - Waling et al., 1989 - غلظت سرب در عصارهها با دستگاه جذب اتمی قرائت گردید
این آزمایش به صورت فاکتوریل و درقالب طرح کاملاً تصادفی و در سه تکرار انجام شد. فاکتورهای آزمایش عبارتند از: سرب - در سه سطح صفر، 500 و 1000 میلیگرم بر کیلوگرم خاک - از منبع نیترات سرب و قارچ - در دو سطح شاهد بدون قارچ و قارچ .
نتایج و بحث خصوصیات خاک مورد استفاده
قبل از شروع آزمایش گلخانهای، برخی ویژگیهای فیزیکی و شیمیایی خاک مورد استفاده اندازه گیری شد که در جدول - 1 - آورده شده است.
جدول :1 برخی ویژگیهای فیزیکی و شیمیایی خاک مورد استفاده
پارامترهای گیاهی
اثر اصلی و متقابل سطوح سرب و گونه قارچی بر ارتفاع، وزن مرطوب و خشک بخش هوایی و ریشه گیاه ذرت معنیدار بود - جدول . - 2 با افزایش غلظت سرب خاک،پارامترهای فوق کاهش یافت به طوری که این کاهش بین سطوح سرب کاملاً معنیدار بود. در تمام سطوح سرب، گیاهان میکوریزی به طور معنیداری مقادیر بیشتری از نظر این پارامترها نسبت به گیاهان غیرمیکوریزی دارا بودند.
جدول :2 تجزیه واریانس اثر سطوح سرب و گونه قارچی بر ارتفاع گیاه، وزن تر و خشک بخش هوایی و ریشه.
مقدار سرب بخش هوایی و ریشه
اثر اصلی و متقابل سطوح سرب و قارچ میکوریز بر مقدار سرب بخش هوایی و ریشه معنیدار بود - جدول . - 3 در بخش هوایی بیشترین مقدار سرب در سطح Pb2 مشاهده شد و تفاوت بین هر سه سطح معنیدار بود. بیشترین مقدار سرب در ریشه نیز در سطح Pb1 مشاهده شد ولی تفاوت بین سطوح Pb1 و Pb2 معنیدار نبود. همچنین مقدار سرب بخش هوایی در سطح Pb2 در گیاهان میکوریزی، به طور معنیداری بیشتر از گیاهان غیرمیکوریزی بود - شکل . - 1 مقدار سرب ریشه در گیاهان تلقیح شده با قارچ میکوریز، به طور معنیداری بیشتر از گیاهان غیرمیکوریزی بود ولی در سطح Pb0 تفاوت معنیداری بین گیاهان میکوریزی و شاهد غیرمیکوریزی مشاهده نشد
