مقاله لاکاز : تولید ، تخلیص و کاربرد در صنایع غذایی

بخشی از مقاله

چکیده

لاکازها به طور گستردهای در گیاهان عالی، باکتریها، قارچها و حشرات پراکنده هستند. این آنزیم در کلم، شلغم، سیبزمینی، گلابی، سیب و سبزیجات دیگر یافت میشود. لاکاز از قارچ آسکومیست، دیوترومیست و باسیدیومیست نیز جداسازی شده است. لاکاز نقش مهمی در صنایع غذایی، صنایع خمیر و کاغذ، صنعت نساجی، شیمی سنتزی، لوازم آرایشی، بازسازی زیستی خاک و تجزیه زیستی آلایندههای فنولیک زیست محیطی و حذف منقطعکننده-های اندوکورین بازی میکند.

با ازدیاد کاربردها در فرآوری مواد غذایی شامل نانوایی و نقش در نانهای بدون گلوتن، تثبیت نوشیدنیها - شراب، آبمیوه و آبجو - و تصفیه زیستی فاضلاب، لاکازها مشخصاً نقش مهمی در فرآوری سبز مواد غذایی بازی میکنند. استفاده از آنزیم لاکاز موجب بهبود ویژگیهای عملکردی و ویژگیهای حسی میشود. لاکاز میتواند برای کاربردهای آنالیتیکی از قبیل بیوسنسورها، آزمایشات آنزیمی و ایمونوشیمیایی به کار رود.

افزودن لاکاز به خمیر مورد استفاده برای محصولات نانوایی موجب بهبود قدرت ساختار گلوتن در خمیر و محصولات پختهشده میشود. استفاده از لاکاز منجر به افزایش حجم، ساختار بهتر مغز نان و نرمی محصولات پختهشده میشود. بسیاری از آبمیوهها شامل فنولیکها و محصولات اکسیداسیون آنها هستند که در رنگ و مزه نقش دارند. واکنشهای کواکسیداسیون و پلیمریزاسیون طبیعی فنولیکها و پلیفنولها در طول زمان موجب تغییرات نامطلوب در رنگ و آروما میشوند. میزان فنولیک آبمیوهها به میزان زیادی بعد از تیمار با لاکاز همراه با افزایش در پایداری رنگ و طعم کاهش مییابد.

مقدمه

در سالهای اخیر، آنزیمها اهمیت زیادی در صنایع پیدا کردهاند: لاکاز یکی از آنهاست که به طور گستردهای در طبیعت موجود است. این آنزیم شامل 15 کربوهیدرات است و جرم مولکولی 60-90 کیلودالتون دارد. این آنزیمها 1و-4بنزن دیول دارای مس هستند: اکسیدوردوکتازهای اکسیژن - EC 1.10.3.2 - که در گیاهان عالی و میکروارگانیسمها یافت میشوند. اینها پلی فنول اکسیدازهای گلیکوزیله هستند که شامل 4 یون مس به ازای یک مولکول میباشند که اکسیداسیون 1 الکترون فنولیک و ترکیبات مربوط به آن را انجام میدهد و اکسیژن را به آب احیا میکند - Couto & . Herrera, 2006 -

زمانی که سوبسترا به وسیله لاکاز اکسید میشود، یک الکترون تکی را از دست داده و عمولاً یک رادیکال آزاد تشکیل میدهد که ممکن است اکسیداسیون بیشتر یا واکنشهای غیرآنزیمی شامل هیدراسیون، نامتجانسسازی و پلیمریزاسیون را متحمل شود. این آنزیمها پلیمریک بوده معمولاً شامل یکی از هر یک از زیرواحد/ مرکز مس نوع 1 ، نوع 2 و نوع 3 میباشند که نوع 2 و نوع3 با تشکیل یک خوشه مس سه هستهای به هم نزدیک هستند.

لاکازها به طور گستردهای در گیاهان عالی، باکتریها، قارچها و حشرات پراکنده هستند. در گیاهان، لاکاز در کلم، شلغم، سیب زمینی، گلابی، سیب و سبزیجات دیگر یافت میشود. لاکازها از قارچ آسکومیست، دیوترومیست و باسیدیومیست که بیش از 60 گونه قارچی متعلق به آنها هستند جداسازی شده است . - Gianfreda et al, 1999 - لاکاز نقش مهمی در صنایع غذایی، صنایع خمیر و کاغذ، صنعت نساجی، شیمی سنتزی، لوازم آرایشی، بازسازی زیستی خاک و تجزیه زیستی آلایندههای فنولیک زیست محیطی و حذف منقطعکننده های اندوکورین بازی میکند.

این آنزیمها برای دلیگنیفیکاسیون خمیر، تجزیه آفتکش، سنتز آلی، سمزدایی ضایعات، تبدیل رنگ منسوجات، استفادههای تکنولوژیکی غذایی و بیوسنسورها و کاربردهای آنالیتیکی استفاده میشوند. اخیراً لاکازها به دلیل توانایی در کاتالیز واکنشهای انتقال الکترون بدون کوفاکتور اضافی به طور مؤثری در نانوبیوتکنولوژی به کار رفتهاند. تکنیک تثبیت بیومولکول مثل لایه-به-لایه، میکروپاترینگ و تکنیک تک لایه خودمونتاژ میتواند برای حفظ فعالیت آنزیمی لاکازها استفاده شود - . - Couto & Herrera, 2006

منابع لاکازها

لاکاز معمولاً در گیاهان عالی و قارچها یافت میشود اما اخیراً در بعضی باکتریها مثل S.lavendulae، S.cyaneus و Marinomonas mediterranea یافت شد. لاکازها در قارچها بیشتر از گیاهان عالی یافت میشوند. باسیدیومیستها مثل Phanerochaete chrysosprium، Theiphora terrestris و Lenzites betulina و قارچ فساد-سفید مثل Phlebia radiate و Pleurotus ostreatus و Trametes versicolour نیز لاکاز تولید میکنند. بسیاری از گونه های Trichoderma مثل T.atroviride، T.harzianum و T.longibrachiatum منابع لاکاز هستند. در گیاهان، لاکاز در لیگنیفیکاسیون نقش دارد در حالی که در قارچها در دلیگنیفیکاسیون، هاگزایی، تولید پیگمان، تشکیل هاگدان و بیماریزایی گیاه درگیر میباشد . - Sheraddha et al, 2011 -

مکانیسم عمل لاکازها

کاتالیز لاکاز با کاهش یک مولکول اکسیژن به آب به همراه اکسیداسیون یک الکترون طیف گستردهای از ترکیبات آروماتیک شامل پلیفنولها، منوفنولهای متوکسی-جانشین و آمینهای آروماتیک اتفاق میافتد. این اکسیداسیون منجر به تولید رادیکال آزاد با مرکز اکسیژن میشود که میتواند به کینون در یک واکنش کاتالیز شده آنزیمی دوم تبدیل شود.

کاتالیز لاکاز در سه مرحله اتفاق میافتد: - 1کاهش مس نوع 1 به وسیله سوبسترا، - 2 انتقال الکترون از مس نوع 1 به مس نوع 2 و خوشه سه هستهای مس نوع 3، - 3 کاهش اکسیژن به آب در خوشه سه هستهای. کاتالیز واسطهدار لاکاز میتواند با استفاده از به کارگیری واسطهها به سوبستراهای غیرفنولیک گسترش یابد. واسطهها گروهی از ترکیبات آلی با وزن مولکولی کم هستند که میتوانند به وسیله لاکاز اکسید شوند ابتدا با تشکیل رادیکالهای کاتیون بسیار فعال که قادر به اکسید کردن ترکیبات غیرفنولیکی هستند که لاکاز به تنهایی نمیتواند اکسید کند. معمولترین واسطههای سنتزی -1هیدرو-زیبنزوتریازول - HOBT - ، -Nهیدرو-زیفتالیمید - NHPI - و 2و2پریم-آزینوبیس--3اتیل-تیازولین--6سولفونات - ABTS - هستند . - Brijwani et al, 2010 -

تولید لاکاز

لاکازها آنزیمهایی هستند که در محیط به طور خارج سلولی به وسیله چندین نوع قارچ در طول متابولیسم ثانویه ترشح میشوند اما همه گونههای قارچی لاکاز تولید نمیکنند مثلاً زیگومیستها و کیتریدیومیستها. Botryosphaeria یک آنزیم اکسید کننده دیمتیل اکسی فنول تولید میکند که یک لاکاز حقیقی است. گونههای آسکومیست که در فساد بیومس گیاه شرکت میکنند شامل ژنهای لاکاز هستند که سیرینگالدازین را اکسید میکند. Cryptococcus neoformans مخمر باسیدیومیست است که لاکاز تولید میکند و فنولها و آمینوفنول را اکسید میکند اما قادر به اکسید کردن تیروزین نیست.

قارچهای باسیدیومیست و ساپروتروف گونههای بسیار مشهوری هستند که مقدار قابل توجهی لاکاز به میزان متغیری تولید میکنند. در مورد Pycnoporus cinnabarinus، لاکاز تنها آنزیم لیگنینولیتیکی است که لیگنین را تجزیه میکند. اخیراً مشخص شده که قارچ فساد-قهوه ای Coniophora puteana سیرینگالدازین را اکسید میکند و اکسیداسیون ABTS را در Laetiporus sulphureus حمایت میکند. چندین فاکتور روی تولید لاکاز تأثیر میگذارند مثل نوع کشت - غوطهوری یا حالت جامد - ، محدودیت منبع کربن و نیتروژن . - Shreddha et al, 2011 -

نوع کشت

روشهای تخمیر غوطه وری و حالت جامد به طور وسیعی برای تولید لاکاز استفاده میشوند. قارچهای رشتهای نوع وحشی برای تولید لاکاز در مقیاس بالا در تکنیکهای مختلف کشت استفاده می شوند.

تخمیر غوطه وری

تخمیر غوطهوری پرورش میکروارگانیسمها در محیط کشت مغذی مایع با غلظت بالای اکسیژن میباشد. ویسکوزیته براث مشکل اصلی مربوط به تخمیرهای غوطهوری قارچی است. هنگامی که سلول قارچی رشد میکند، میسلیوم تشکیل میشود که پیشرفت کار را به تأخیر میاندازد به این دلیل که محدودیت در انتقال اکسیژن و جرم اتفاق میافتد. برای رفع این مشکل، استراتژیهای مختلفی به کار رفتهاند.

بیوراکتور برای به دست آوردن راندمان بالا به شیوه مداوم عمل میکند. مشکلات ویسکوزیته براث، انتقال جرم و اکسیژن با تثبیت سلول حل میشوند. تحقیقات نشان داده که تولید مداوم لاکاز بدون غیرفعال شدن آنزیم برای یک دوره چند ماهه به دلیل تثبیت روی غشا میتواند انجام شود. مؤثرترین شیوه تولید لاکاز عملیات Fed-batch است که از طریق آن بالاترین فعالیت لاکاز میتواند به دست آید - . - Shreddha et al, 2011

تخمیر حالت جامد

تخمیر حالت جامد برای تولید آنزیمها با استفاده از سوبستراهایی مثل بقایای کشاورزی مناسب است چون آنها شرایطی را که قارچ به طور طبیعی تحت آن فعالیت میکند تقلید میکنند. لیگنین، سلولز و همیسلولزها سرشار از قند هستند و رشد قارچ در فرمانتور را افزایش میدهند و فرآیند را اقتصادیتر میسازند. اشکال اصلی طرح بیوراکتور این است که انتقال جرم و حرارت محدود میشود. شکلهای مختلف بیوراکتور برای تولید لاکاز بررسی شدهاند مثل شکل غوطهوری، بستر منبسط شده، سینی، ساپورت خنثی - نایلون - و غیرخنثی - سبوس جو - که در این میان شکل سینی بهترین نتیجه را به همراه داشته است.

تولید لاکاز به وسیله تخمیر حالت جامد و غوطهوری در مورد سبوس برنج نسبت به سوبستراهای دیگر بالاتر است. قابلیت القایی سبوس برنج بر اساس ترکیبات فنولیک مثل فرولیک اسید و وانیلیک اسید است که تولید لاکاز را تحریک میکند. بسیاری از ضایعات کشاورزی مثل دانه انگور، ساقه انگور، سبوس جو، ساقه پنبه، آب ملاس و سبوس گندم نیز به عنوان سوبسترا برای تولید لاکاز استفاده میشوند. با این حال تولید لاکاز در تخمیر غوطهوری و حالت جامد به میزان حداکثر نمیرسد به همین دلیل است که کشت طولانی لازم است . - Shreddha et al, 2011 -

تخلیص لاکاز

معمولاً سولفات آمونیوم برای تخلیص آنزیم استفاده میشود اما محققان روشهای مؤثرتری مثل ترسیب پروتئین به وسیله سولفات آمونیوم، کروماتوگرافی تبادل یون، نمکزدایی/تبادل بافر پروتئین و کروماتوگرافی ژل فیلتراسیون را یافتهاند. تخلیص یک مرحلهای لاکاز از Neurospora crassa با استفاده از کروماتوگرافی سلیت صورت گرفت و تخلیص 54 برابری با فعالیت ویژه 333 U/mg به دست آمد. لاکاز از T.versicolour با استفاده از ترسیب اتانولی، -DEAEسفاروز، فنیل -سفاروز و سفادکس G-100 کروماتوگرافی تخلیص میشود که یک لاکاز منومری با فعالیت ویژه 91443 U/mg است.

لاکاز از T.veriscolour با کروماتوگرافی تبادل یون و به دنبال آن ژل فیلتراسیون با فعالیت ویژه 101 U/ml و تخلیص 34/8 برابر تخلیص میشود. لاکاز از Stereum ostrea با سولفات آمونیوم و به دنبال آن کروماتوگرافی ستونی سفادکس G-100 با 70 برابر خالص-سازی تخلیص میشود. لاکاز از هاگدان با ترسیب سولفات آمونیوم با اشباعیت 40-70 و کروماتوگرافی DEAE سلولز تخلیص شد و 1/34 و 3/07 برابر خالصسازی به ترتیب به دست آمد . - Shraddha et al, 2011 - بعضی از لاکازهای تجاری در جدول زیر آورده شده است - Osma et