بخشی از مقاله
چکیده
بیوسنسورها یک گزینه انتخابی مهم در بخش کشاورزی و مواد غذایی برای کنترل محصول و فرآیند، اطمینان از کیفیت و ایمنی غذا به وسیله شیوه-های مقرون به صرفه و سریع هستند. بیوسنسورها سیستمهای بیولوژیکی شناسایی و در واقع ابزارهای تجزیهای هستند که با استفاده از مواد بیولوژیکی یا مشتقات آنها که در یک مبدل تثبیت شدهاند، میزان یک یا چند آنالیت را اندازهگیری میکنند.
مزایای بیوسنسورها نسبت به روشهای آنالیتیکی متداول شامل اندازه، هزینه، اختصاصی بودن، پاسخ سریع، دقت و حساسیت میباشد. اکراتوکسینها گروهی از متابولیتهای ثانویه قارچی بسیار سمی هستند که به وسیله چندین گونه از جنس آسپرژیلوس و پنیسیلیوم تولید میشوند. گونههای تولیدکننده اکراتوکسین در سرتاسر دنیا یافت شده و ممکن است محصولات کشاورزی را قبل و یا پس از برداشت آلوده کنند.
آلودگی به اکراتوکسین در انواع زیادی از مواد غذایی مثل دانه غلات، دانههای روغنی، میوههای خشکشده، دانه کاکائو و قهوه، آجیل، غذای کودک و در نوشیدنیهایی مثل آب انگور یافت شده است. در حال حاضر روشهای آنالیتیکی مختلفی برای تعیین اکراتوکسینها در انواع ماتریکسها وجود دارند از قبیل کروماتوگرافی لایه نازک، کروماتوگرافی گازی، کروماتوگرافی مایع با کارایی بالا و الایزا. به دلیل مشکلات این روشها، نیاز رو به افزایشی برای ایجاد یک روش حساس ساده مثل بیوسنسورها برای تشخیص اکراتوکسین-ها وجود دارد. از این رو، تاکنون بیوسنسورهای مختلفی برای تشخیص اکراتوکسینها در محصولات غلات ساخته شده و نتایج مطلوبی به دست آمده است.
مقدمه
امروزه در زمینههای مختلفی از جمله پزشکی، صنایع شیمیایی، صنایع غذایی، پایش محیط زیست و تولید محصولات دارویی و بهداشتی از بیوسنسورها بهره میگیرند. این سنسورها ابزاری توانمند جهت شناسایی مولکولهای زیستی میباشند. به عنوان مثال حواس بویایی و چشایی انسان نمونهای از یک بیوسنسور طبیعی است که به شناسایی بوها و طعمهای مختلف میپردازد.
سیستم ایمنی بدن نیز یک بیوسنسور طبیعی است، که میلیونها نوع مولکول مختلف را شناسایی میکند. در حقیقت بیوسنسورها ابزارهای آنالیتیکی هستند که میتوانند با بهره گیری از هوشمندی مواد بیولوژیکی، ترکیب یا ترکیباتی را شناسایی نموده و با آنها واکنش دهند. محصول این واکنش میتواند یک پیغام شیمیایی، نوری و یا الکتریکی باشد. بیوسنسورها سیستمهای بیولوژیکی شناسایی و در واقع ابزارهای تجزیهای هستند که با استفاده از مواد بیولوژیکی یا مشتقات آنها که در یک مبدل تثبیت شدهاند، میزان یک یا چند آنالیت را اندازهگیری میکنند.
بیوسنسورها از 5 بخش: گیرنده زیستی - Bioreceptor - ، مبدل - Transducer - ، تقویت کننده - Amplifier - ، پردازشگر - Processor - و نمایشگر - Recorder - تشکیل شدهاند . - Mohanty & Kougianos , 2005 - در سال 1962 للاند سی کلارک الکترودی اختراع کرد که اکسیژن محلول در خون بیماران تحت جراحی را اندازه میگرفت. او یک الکترود پلاتینیوم و الکترود رفرنس را با یک غشای پلاستیکی نفوذپذیر به گازها احاطه کرد. اختلاف ولتاژ بین gave اندازهگیری شد میزانی که در آن اکسیژن منتشر می-شود. کلارک ایده این الکترود را برای ساخت سنسورهای گلوکز گسترش داد. با این حال این شیوه به مراقبت روتین بیمار تبدیل نشد. این به دلیل کاهش دقت ناشی از تشکیل لختههای خون اطراف الکترود بود . - Clark & Lyons, 1962 -
کاربرد بیوسنسورها در صنایع غذایی
بیوسنسورها یک گزینه انتخابی مهم در بخش کشاورزی و مواد غذایی برای کنترل محصول و فرآیندها، اطمینان از کیفیت و ایمنی غذا به وسیله شیوه-های مقرون به صرفه و سریع هستند. بیوسنسورها جایگزین نویدبخشی برای ابزارهای آنالیتیکی متداول هستند چون مزایایی از نظر اندازه، هزینه، اختصاصی بودن، پاسخ سریع، دقت و حساسیت ارائه میکنند. اگر چه پیشرفت اولیه در تکنولوژیهای بیوسنسور در زمینه پزشکی انجام شد، قابلیت آشکارسازی، آنالیز و اندازهگیری مولکولهای منابع بیولوژیکی مختلف و تنوع اصول اندازهگیری منجر به ایجاد طرحهای بیوسنسور برای پوشش طیف وسیعی از نیازهای تکنیکی شد.
اصول عملیاتی مختلف منجر به ایجاد بیوسنسورها برای آنالیز مواد خارجی در محصولات غذایی مثل حشرهکشها، بقایای کودها و دیوکسینها، بقایای آب و خاک - به طور تصادفی به زنجیره غذا وارد شده - ، ارگانیسمهای تغییر ژنتیکی شده، میکروارگانیسمهای پاتوژن و سم آنها و ترکیبات غذایی مثل مواد ضدتغذیهای، آلرژنها، داروها، افزودنیها و هیدروکربنها شده است . - Serna & Perenguez, 2011 -
اکراتوکسینها در محصولات غذایی
اکراتوکسینها گروهی از متابولیتهای ثانویه قارچی بسیار سمی هستند که به وسیله چندین گونه از جنس آسپرژیلوس و پنی سیلیوم تولید میشوند. گونه های تولیدکننده اکراتوکسین در سرتاسر دنیا یافت شده و ممکن است محصولات کشاورزی را قبل و یا پس از برداشت آلوده کنند - Vander et .al, 1965; Stormer, 1992 - حداقل 9اکراتوکسین عمدتاً متشکل از اکراتوکسین A، B و C تشخیص داده شده اما اکراتوکسین A رایجترین و سمیترین سم مربوط به این گروه است . - Rai & Varma, 1992 - به دلیل خطری که برای سلامت انسان و حیوان ایجاد میکند به این سم بسیار توجه میشود.
نشان داده شده که اکراتوکسین A برای تمام گونههای حیوانی مورد آزمایش نفروتوکسیک، کارسینوژن، ایمونوتوکسیک و تراتوژن می-باشد . - Steyn & Stander, 1999 - آلودگی به اکراتوکسین A در طیف گستردهای از مواد مثل دانه غلات - ذرت، گندم، جو، چاودار - ، دانههای روغنی، میوههای خشک شده، دانه کاکائو و قهوه، آجیل، غذای کودک و در نوشیدنیهایی مثل آبجو، شراب و آب انگور یافت شده است - Rai & .Varma, 2010 - اکراتوکسین A در محصولات کشاورزی خام که به عنوان علوفه استفاده شدهاند میتواند بدون تغییر از زنجیره غذایی عبور کرده و در گوشت و محصولات گوشتی موجود باشد.
به دلیل پایداری اکراتوکسین A در زنجیره غذایی مشکلات جدی را برای سلامت انسان مطرح میکند . - Araguas et al, 2005; Battilami et al, 2003 - انجمن ایمنی غذای اروپا - EFSA - به طور مفصل خطرات اکراتوکسین A را ارزیابی کرده و مقادیر مجاز حداکثر موجود در غذا و محصولات علوفهای و مواد خام را تعیین کرده است 10 ʽg/kg - در کشمش و قهوه فوری، 5 ʽg/kg در دانه خام غلات و قهوه بوداده شده، 3 ʽg/kg در غذای غلات فرآوری شده و 2 ʽg/kg در آب انگور و انواع شراب - . - Bayman & Baker, 2006 - در حال حاضر روشهای تجزیهای مختلفی برای تعیین اکراتوکسین A در انواع ماتریکسها وجود دارند.
روشهای کروماتوگرافی مثل کروماتوگرافی لایه نازک، کروماتوگرافی گازی و کروماتوگرافی مایع با کارایی بالا با ستون های ایمونوافینیتی و آشکارسازی فلورسنس در دسترس هستند که روشهای حساس و خاصی فراهم میکنند اما در کل به چندین مرحله قبل از آشکارسازی نیاز دارند. چنین تیمارهایی نه تنها آنالیز را زمانبر و پر هزینه میکند بلکه به پرسنل با مهارت نیز نیاز دارد. روشهای ایمونولوژیکی مثل ELISA نیز قابل استفاده هستند.
عیب اصلی ELISA زمان لازم برای آزمایش، حجمهای زیاد در مقایسه با آزمایشاتی مثل بیوسنسور و نتایج غربالگری اشتباه مثبت یا منفی مکرر است.اخیراً بعضی تکنیکهای جدید ایمونوسنسینگ برای غربالگری سریع اکراتوکسین A به وجود آمدهاند. به ویژه بیوسنسورهای Biacore که پدیده رزونانس پلاسمون سطحی را برای پایش آنی برهمکنش بین مولکولها به کار میگیرند که مشخص شده برای این منظور بسیار مفید و قابل استفاده است . - Yuan et al, 2009 -
تشخیص اکراتوکسین A در مواد غذایی با استفاده از بیوسنسورها
یوان و همکاران - 2009 - یک ایمونوسنسور رقابتی حساس و سریع برای تشخیص اکراتوکسین A با استفاده از نانوذرات طلا برای افزایش سیگنال روی یک سطح تک لایه خودمونتاژ - mSAM - ایجاد کردند. در این تحقیق از آزمایش ایمنی رقابتی برای سنجش اکراتوکسین A استفاده شد که بر اساس تثبیت اکراتوکسین A هدف از طریق کنژوگه اوالبومین با یک اتصال دهنده پلی اتیلن گلایکول بود - اکراتوکسین -Aپلی اتیلن گلایکول -اوالبومین - .
اندازهگیریهای SPR با استفاده از سیستم بیوسنسور SPR نوری - Biacore Q - مجهز به نرم افزار ارزیابی و کنترل BIA انجام شد. این کنژوگه جدید در مقایسه با سطح تثبیت شده کنژوگه اکراتوکسین -A آلبومین سرم گاوی تجاری بدون اتصال دهنده پلی اتیلن گلایکول به طور قابل توجهی خصوصیات عملکردی آن افزایش یافت و به دلیل دانسیته بالاتر یا دسترس پذیری زیستی بالاتر اکراتوکسین A کنژوگه با پروتئین و یک اتصال دهنده بلند پلی اتیلن گلایکول، پیوستگی بیشتری با آنتیبادی دارد که به طور قابل توجهی واکنش اتصال آنتیبادی را افزایش و بنابراین عملکرد آزمون SPR را بهبود داد.
استفاده از نانوذرات طلا به عنوان لیبل خارجی روی سطح /mSAMآنالیت- پلی اتیلن گلایکول-اوالبومین برای افزایش حساسیت آزمون اکراتوکسین A موجب افزایش 17 برابری سیگنال و بهبود دوبرابری در حد آشکارسازی شد. اگرچه غلظتهای کم اکراتوکسین A در حد 1 /5 ng/ml میواندت مستقیماً روی سطح اکراتوکسین -Aپلی اتیلن گلایکول-اوالبومین تشخیص داده شود، حد آشکارسازی میتواند به میزان زیادی تا ng/ml 0/042 برای اکراتوکسین A با کاربرد نانوذرات طلا برای افزایش سیگنال بهبود یابد.
شرایط شیمیایی مختلفی برای کاهش تأثیر ماتریکس غذایی روی عملکرد آزمایش بررسی شد. یک استخراج یک مرحلهای ساده با متانول آبی 50 برای نمونههای غلات - جو دوسر و ذرت آسیاب شده - یا پیش تیمار با پلی وینیل پیرولیدین 3 یا 5 برای نمونههای مایع - شراب و آبمیوه - برای حذف مزاحمت پلی فنولها و تنظیم pH، تشخیص ساده و سریع اکراتوکسین را فراهم میکند. حد آشکارسازی برای اکراتوکسین A در جو دوسر و ذرت 0/3 ng/ml و 0 /5 و برای شراب و نوشیدنیهای دیگر در محدوده 0/058- 0/4 ng/ml بود و زمان کلی برای آنالیز نمونه کمتر از 10 دقیقه - بعد از استخراج - بود.
هیچ برهمکنش عرضی با سایر مایکوتوکسین-های معمول - آفلاتوکسین M1، داکسی نیوالنول و ذرالنون - مشاهده نشد که نشان میدهد که این آنتی بادی برای اکراتوکسین A روی این سطح اختصاصی است . همچنین این تکنیک از واکنشگرهای ارزان - IgG/nano gold - استفاده میکند تا به طور قابل توجهی غلظت واکنشگر گران منوکلونال آنتی بادی مورد استفاده در آزمون را کاهش دهد.
همچنین سطح /mSAMاکراتوکسین -A پلی اتیلن گلایکول- اوالبومین پایداری بالاتری داشته و قادر به عملکرد در بیش از 600 سیکل اتصال-باززایی تنها با یک تراشه است. درکل این شیوه با آمادهسازی ساده نمونه یک ابزار قوی برای تعیین کمی سریع و مقرون به صرفه اکراتوکسین A در ماتریکس های غذایی فراهم میکند. حد آشکارسازی اکراتوکسین A در غلات به این روش کمتر از اندازهگیریهای بیوسنسورهای دیگر است و مشابه مقادیر به دست آمده از ELISA/HPLC بوده اما بسیار سریعتر و آسانتر به دست میآیند. - Yuan et al, 2009 -
در تحقیق بونل و همکاران - 2011 - قابلیتهای طرحهای آزمایش رقابتی روی میکرودانههای پارامغناطیسی به کار رفته در آپتاسنسورهای الکتروشیمیایی برای مایکوتوکسین اکراتوکسین A آزمایش شد. به طور متداول جداسازی مغناطیسی در بیوسنسورهای الکتروشیمیایی DNA بر اساس هیبریدیزاسیون به عنوان شیوه خوبی برای جمعآوری هدف نوکلئیک اسید دیگر یعنی DNA و RNA استفاده شده است اما به ندرت در آزمایشات آپتاسنسور استفاده شدهاند. با استفاده از میدان مغناطیسی دانهها به آسانی جداسازی شدند که موجب درگیری بسیار مؤثر و مراحل شستشو و تشخیص بسیار کارامد شد.
سپس یک آهنربای خارجی برای متمرکز کردن میکرودانههای اصلاحشده نزدیک به سطح الکترود و برای جداسازی آنها از واکنشگرهای دیگر که در فرآیندهای آنالیتیکی برای اکراتوکسین A درگیر هستند استفاده شد و از جذب سطحی غیراختصاصی جلوگیری شد. بیوسنسور بر پایه آپتامر بسیار انتخابی است و حساسیت کمی بیشتر از یک بیوسنسور بر پایه آنتی بادی منوکلونال دارد .
علاقه به آپتامرها - گاهی موسوم به به آنتیبادیهای شیمیایی - از مزیتهای آن ها نسبت به آنتیبادیها نشأت میگیرد: اختصاصی بودن، اندازه کوچکتر - جرم مولکولی 5-15 کیلودالتون - ، تولید آزمایشگاهی آسانتر - شامل ترکیبات سمی - ، مقاومت بیولوژیکی، حرارتی و شیمیایی و یک ساختار اتصال لیگاند بسیار تکرارپذیر. آزمایشات نوع ساندویچ یکی از معمولترین شیوههای مورد استفاده برای آپتاسنسورهای الکتروشیمیایی مولکولهای بزرگ هستند. اگرچه این استراتژی برای مولکولهای با اندازه کوچک - مثلاً برای اکراتوکسین - A مناسب نیست. یک بیوسنسور بر پایه آپتامر رقابتی الکتروشیمیایی برای اکراتوکسین A طراحی شد.
دانههای میکروذرات پارامغناطیسی - MBs - با یک آپتامر ویژه اکراتوکسین A عاملدار شدند و اجازه داده شد که با یک محلول مایکوتوکسین کنژوگه با آنزیم پراکسیداز شلغم - اکراتوکسین -Aپراکسیداز شلغم - و اکراتوکسین A آزاد رقابت کند. بعد از مراحل جداسازی و شستشو به کمک جداسازیهای مغناطیسی میکرودانهها روی الکترودهای کربن صفحه پرینت شده قابل مصرف تحت یک میدان مغناطیسی قرار گرفتند و محصول واکنش آنزیمی با سوبسترا با ولت سنجی پالس دیفرانسیل آشکار شد.
علاوه بر آزمایشات جداسازی مغناطیسی، طرحهای رقابتی دیگر - مستقیم/ آپتاسنسورهای غیرمستقیم انجام شده روی سطح SPCE یا با استفاده از نانوذرات طلا عامل دار شده با آپتامر - به طور مقدماتی آزمایش بهینهسازی و مقایسه شدند. آپتاسنسور مغناطیسی یک پاسخ سطحی به اکراتوکسین A در محدوده 0/78-74/8 ng/ml و یک حد آشکارسازی 0/07 0/01 ng/ml نشان داد و به طور دقیق برای عصارههای نمونههای گندم گواهی شده و آلوده شده با یک RSD کمتر از حدود 0/8 به کار رفت. - Bonel et al, 2011 -
نتیجهگیری
استفاده از تکنولوژی بیوسنسورها برای ایمنی غذا، برآورده کردن استاندارد های ایمنی و کیفی بین المللی را تسهیل می کند و آشکارسازی مؤثر، ایمن و موثق و تعیین مقدار میکروارگانیسم های پاتوژن مرتبط با بیماری های با منشأ غذایی و آلاینده های غیرآلی تهدیدکننده سلامت مصرف کننده را اجازه می دهد. به هر حال آشکارسازی غلظت های کم مواد آلوده کننده شیمیایی و بیولوژیکی در محصولات برای مصرف انسان و حیوان لازم است. انتخابی بودن، اختصاصی بودن و پاسخ سریع، به سیستم های پذیرش و انتقال بیوسنسور بستگی دارد چون آن ها بر اساس ثبت واکنش هایی هستند.
