بخشی از مقاله
چکیده
استفاده از طرح های آماری جهت بهینه سازی فرایند آنزیم آلفا آمیلاز از کپک آسپرژیلوس اوریزا با استفاده از ضایعات گندم آسیاب به عنوان تنها منبع کربنی و عوامل موثر بر تولیدبهینه سازی شرایط دما، سرعت هم زدن،حجم و اندازه مایع تلقیح توسط طرح باکس- بنکن با روش سطح پاسخ انجام گرفت سپس با استفاده از طرح پلاکت-برمن 19 ماده مغذی موثر بر تولید آنزیم آلفاآمیلاز تعیین گردید.
بهینه سازی غلظت مواد مغذی با استفاده از طرح تاگوچی امکان پذیر شد. اوره، گلیسرول، KH2PO4، - NH4 - 2SO4، CoCl2، کازئین هیدرولیز شده، کنجاله سویا هیدرولیز شده و MgSO4 بر اساس تاثیر مثبت شان روی تولید آنزیم انتخاب شدند.آنالیز داده ها یک افزایش نظری %73 ای در بیان آنزیم از 40.1 تا U/ml 151.1 پیش بینی کردند. این شرایط از نظر آزمایشی دارای اعتبار بوده و بازدهی تولید آنزیم را تا %72.7 افزایش دادند. بهینه سازی فرایند تولید نقش موثری در کاربرد مفید عوامل تولید در یک فرایند بیوتکنولوژیکی خواهد داشت و سبب افزایش بازدهی آنزیم خواهد شد.
مقدمه
بسیاری از محصولات نشاسته ای فرعی حاصل پروسه های صنعتی هستند و یک منبع مناسب کربن به شمار میروند. استفاده از این منابع به منوان محیط کشت هزینه تولید برخی مواد به خصوص مواد باارزش نظیر آنتی بیوتیک ،آنزیم و ... را کاهش میدهد. برخی از این منابع به عنوان سوبسترای ارزان صنعتی مدنظر هستند و همچنین در کاهش مشکلات الودگی محیط نقش دارند.
گروئل - محصول جانبی حاصل از آسیاب گندم - یکی از این محصولات فرعی است که به عنوان سوبسترا جهت تولید تولیدات زیستی عملگرا نظیر آفت کش های زیستی از باسیلوس تورینژنس - Zouari et al., 2002 - و پپتیدهای خاص برای رژیم غذایی اطفال - - Kammoun et al., 2003 مورد توجه است. آنزیم آمیلاز برای بسیاری از پروسه های صنعتی مثل تولید نان، فراوری نشاسته، داروسازی، منسوجات و صنعت کاغذ کاربرد دارد.
آلفا آمیلازها - E.C.3.2.1.1.: endo a-1-4 glucan-4 -glucanohydrolase - آنزیم های خارج سلولی که واحدهای گلوکز را از زنجیره خطی آمیلوز جدا میکنند و به عنوان متابولیت اولیه میکروارگانیسم ها مطرح هستند - Spohr et al., 1998; Sudo et al., 1994 - . آسپرژیلوس اوریزا به طور گسترده ای در تولید غذاهایی نظیر سس سویا - Manabe et al., 1984 - ، اسیدهایی آلی نظیر سیتریک و استیک و آنزیم های تجاری شامل آلفاآمیلاز - Ramachandran et al., 2004 - استفاده میشود.
کربوهیدارت های دارای باندهای آلفا-1و4 گلوکوزیدیک نظیر مالتوز یا نشاسته - Lachmund et al., 1993 - ، و مالتو دکسترین ها Carlsen and Nielsen - 2001 - محرک بیان الفا امیلاز هستند. به علاوه طبق مطالعات Nirmala and Muralikrishna - 2003 - تویین 80 و کلسیم به ترتیب قادرند فعالیت آلفاامیلاز را افزایش دهند. بهینه سازی پارامترهای فیزیکی و شیمیایی پروسه های تخمیر از تمهیدات ابتدایی ضروری است زیرا تاثیر مهمی بر هزینه تولید و قابلیت انجام فرایند میگذارد.
بهینه سازی فرایندهای تخمیری در ابتدا با تغییر یک پارامتر و ثابت نگاه داشتن باقی انجام میشد این روش برای فرایندهای چند متغیره به علت صرف زمان و عدم تشخیص نقطه بهینه - به علت برهم کنش بین فاکتورها - نامناسب است . - Weuster-Botz, 2000 - طرح های آماری - طرح های آ زمایشی فاکتوریل - مجموعه ای از استراتزیهای آزمایشی، روش های ریاضی و آماری است که قادر به توضیح برهم کنش بین چند فاکتور درگیر در فرایند است - . - Elibol, 2004
در این پژوهش بهینه سازی تولید آنزیم آلفاآمیلاز توسط آسپرژیلوس اوریزا با استفاده از حریره گندم به عنوان بستر کشت مورد بررسی قرار گرفته است.پارامترهای هیدرو و ترمودینامیکی - دما و هم زدن - و غلظت مایع تلقیح توسط طرح باکس- بنکن با سه سطح و با استفاده از روش سطح پاسخ - RSM - انجام گرفته است. ترکیب مواد مغذی با استفاده از طرح پلاکت-برمن و غلظت مواد مغذی با استفاده از طرح تاگوچی بهینه سازی شد .
روش ها میکروارگانیسم ، محیط کشت در این پژوهش سویه قارچ آسپرژیلوس اوریزا - CBS 819.72 خریداری شده از Centraalbureau voor Schimmelcultures, The - Netherlands استفاده شد که روی آگار دکستروز سیب زمینی - PDA - در 30 درجه سانتیگراد تکثیر شده بود.پلیت ها به مدت 5 تا 7 روز رشد داده شدند سپس در 4 درجه سانتیگراد نگه داری شدند.
آماده سازی برای تلقیح آسپرژیلوس اوریزای 7 روزه توسط افزودن 10 میلی لیتر آب مقطر حاوی %0.1 تویین 80 از پلیت ها برداشت شدند. اسپورها توسط سوزن تلقیح تحت شرایط اسپتیک خارج شدند. پس از سانتریفوژ در 9000g به مدت 20 دقیقه و 4 درجه سانتیگراد و حذف سوپرناتانت ، گلیسرول به سوسپانسیون افزوده شد . سپس آن را برای رسیدن به چگالی مورد نیاز اسپور رقیق شد و به عنوان سوسپانسوین اصلی مورد استفاده قرار گرفت.تعداد اسپورها در مایع تلقیح توسط تکنیک سلول توماس تعیین شد.
سوبسترا و بستر کشت حریره بدست آمده از پردازش سمولینای گندم دوروم به عنوان سوبسترا مورد استفاده قرار گرفت شامل %60 نشاسته، سایر کربوهیدارت ها %5، سلولز %1.5، گلوتن %12، و نیتروژن کل %2.1 بود. به یک ارلن مایر 500 میلی لیتری مقدار 2.5 گرم حریره گندم اضافه شد که با محیط تولید آنزیم مخلوط شده بود 100 - میلی لیتر - حاوی - گرم بر لیتر - : پپتون 10، عصاره مخمر 5.0، نمک طعام 10، 0.5 KH2PO4، 0.5 MgSO4، 0.5 CaCl2 و آب مقطر . محتوای فلاسک به طور کامل مخلوط شده و pH ابتدایی در حد 5.0 تعیین شد. درپوش ارلن مایر در 121 درجه سانتیگراد ، فشار 15 psi به مدت 20 دقیقه اتوکلاوگذاری شد . پس از سرد شدن محیط با حجم متناسبی از سوسپانسیون تلقیح شده و سپس در روتاری چرخان تحت شرایط ثابت به مدت 72 ساعت گذاشته شد.
سنجش آنزیم
با افزودن 50 میکرومول آنزیم کشت سوپرناتانت به محلول نشاسته 0.5 میلی لیتر %1 وزنی/حجمی در بافر استات 0.1 مولار - pH 5.6 - و انکوباتورگذاری آن در 60 درجه سانتیگراد به ممدت 30 دقیقه ، آلقاآمیلاز مورد سنجش قرار گرفت. قندهای احیا توسط روش 3و-5دی نیترو سالیسیک اسید معین شد. یک واحد از آنزیم آلفاآمیلاز مقداری از آن تعریف میشود که قادر است قندهای احیا معادل 1 میکرومول از گلوکز را تحت شرایط استاندارد آزمایشی آزاد کند.
طرح های آزمایشی و آماری بهینه سازی پارامترها - دما، هم زدن و اندازه مایع تلقیح - برای تولید بیشتر آمیلاز توسط طرح جعبه بنکن که نیاز به سه سطح با کد - - - ، - 0 - و - + - ، 13 - - N=13 - آزمایشها و سه فاکتور در سه سطح - با روش سطح پاسخ انجام شد. طرح باکس- بنکن یک طرح فاکتوریل کسری است که از ترکیب طرح های فاکتوریل دوسطحی با طرح بلوک ناقص بدست آمده است.
روش سطح پاسخ جهت آنالیز داده های طرح های آزمایشی مورد استفاده قرار گرفت. نتایج و بحث بهینه سازی پارامترهای عملیاتی برخلاف pH که بین رنج 5 تا 5.5 بکار گرفته شد، سایر پارامترها مثل دما، هم زدن، و اندازه مایع تلقیح به عنوان کنترل کننده ترین پارامترها در تولید آنزیم آلفاآمیلاز توسط آسپرژیلوس اوریزا شناخته شدند. طرح باکس - بنکن برای آنالیز برهم کنش های بین پارامترها و تعیین شرایط بهینه تولید آنزیم بکار گرفته شد. نتایج این آنالیز در جدول 1 مشاهده میشود .
میانگین فعالیت آفاآمیلاز مقادیر سه تکرار به عنوان متغیر وابسته یا پاسخ Y در نظر گرفته شد. نتایج توسط نرم افزار آماری SPSS آنالیز شدن و سطح پاسخ توسط EXCEL ایجاد شد. مدل رگرسیون توسط SPSS بطوری تعیین شد که در ابتدا تمامی فاکتورها و سپس مرحله به مرحله فاکتورهای غیر موثر حذف گردید. بنابراین معادله مدل توسط آنالیز رگرسیون تعیین شد از معادله مدل استنباط میشود موثرترین پارامتر S یا همان اندازه تلقیح است. اهمیت این پارامتر در تولید آنزیم آلفاآمیلاز قبلا توسط Francis et al. - 2003 - گزارش شده است. دومین پارامتر موثر دماست که تاثر معکوسی روی تولید آنزیم توسط آسپرژیلوس اوریزا دارد که این نتایج با نتایج گزارش شده توسط Francis et al. - 2003 - مطابقت دارد.
سرعت به هم زدن به طور محدودی روی تولید آنزیم اثر مثبت دارد به طوری که افزایش هم زدن سبب افزایش محدود تولید آنزیم میشود به شرطی که هوادهی برای رشد سویه های هوادوست مناسب باشد. سطح پاسخ ها برهم کنش بین پارامترها را نشان میدهد در حالیکه پارامتر سوم ثابت نگاه داشته شده باشد. در روش سطح پاسخ تاثیر برهم کنش بین دما و هم زدن، هم زدن و اندازه تلقیح، و دما و اندازه تلقیح روی تولید آلفا آمیلاز مشخص شد.
این روش توضیح میدهد که با کاهش دما از 32 به 25 درجه سانتیگراد هم زمان با افزایش هم زدن از 150 تا 250 دور بر دقیقه سبب افزایش در بازدهی تولید آنزیم میشود به عبارت دیگر آسپرژیلوس اوریزا قادر به تحمل سرعت های بالای هم زدن در دماهای مزوفیلیک میباشد و دما و هم زدن میتوانند به طور معناداری روی تولید آنزیم آلفاآمیلاز توسط کپک تاثیر بگذارند. با افزایش دما به بالاتر از محدوده مزوفیلیک رشد کپک و تولید آنزیم کاهش میابد. همچنین افزایش اندازه تلیقح تا یک حد بهینه سبب افزایش تولید آنزیم میشود و اقزایش بیشتر سبب کاهش بازدهی تولید آنزیم میشود.
غربالگری مکمل های مواد غذایی
طرح پلاکت برمن برای تعیین مکمل های غذایی کشت به توصیه Francis et al. - 2003 - انتخاب شد.
