بخشی از مقاله
چکیده:
کشت سلولی با تراکم بالا - HCDC - روشی قدرتمند برای تولید زیست توده و پروتئین های نوترکیب است. برای رسیدن به کشت سلولی با تراکم بالا باید محیط کشت، استراتژی خوراک دهی و شرایط رشد بهینهسازی شوند. در کشت سلولی با تراکم بالا مقادیر زیادی سوبسترا مورد نیاز است و تعداد زیادی سلول تولید میشود. برای دستیابی موفق به کشت سلولی با تراکم بالا و تولید پروتئین نوترکیب روش کشت نیز مهم است که بستگی به عوامل مختلفی از جمله متابولیسم ارگانیسم، تولید ترکیبات بازدارنده، شرایط القاء و عوامل دیگری دارد.
روش های مختلفی برای کشت سلول های در حال رشد با تراکم بالا استفاده می شود، که شامل موارد زیر است: روش غیر مداوم - Batch - ، روش مداوم - continuous - و روش غیر مداوم خوراک دهی شده - . - Fed-batch روش غیر مداوم خوراک دهی شده معمول ترین روش مورد استفاده است. متغیرهای قابل اندازه گیری جهت کنترل سیستم های بیولوژیکی به طور مستقیم - آنلاین یا آفلاین - و یا به طور غیرمستقیم اندازهگیری میشوند.
متغییرهایی که به طور مستقیم اندازه گیری می شوند شامل دما، pH، غلظت اکسیژن محلول - DO - ، دانسیته نوری - OD - ، غلظت سوبسترا، فشار و ترکیب گاز خروجی است. متغیرهایی که به طور غیرمستقیم اندازهگیری میشوند شامل: سرعت رشد ویژه، غلظت سلول، سرعت مصرف اکسیژن، سرعت انتقال اکسیژن، سرعت تولید دی اکسیدکربن، سرعت مصرف گلوکز - یا سوبستراهای دیگر - و بهره ی تنفسی - RQ - است.
مقدمه:
کشت سلولی با تراکم بالا - HCDC - یک روش قدرتمند برای تولید پروتئین های نوترکیب است که اولین بار برای تولید پروتئین تک سلولی از مخمرها، اتانول و زیست توده به کار گرفته شد. پس از آن، کشت متراکم مزوفیل های دیگر برای تولید محصولات مختلف مانند تولید آنتی بیوتیک از streptomycetes ها مورد استفاده قرار گرفت - سوزوکی و همکاران . - 1987 امروزه ترکیبی از فرآیندهای کشت در مقیاس بزرگ با تکنولوژی DNA نوترکیب، توانسته است پروتئین هایی مانند اینترفرون، اینترلوکین، عوامل محرک کلونی و هورمون های رشد را در مقادیری که اگر برای به دست آوردن آن ها، از منابع طبیعی استفاده کنیم، اگر غیرممکن نشود، دشوار می شود. کشت های سلولی با تراکم بالا، یک پیش نیاز برای به حداکثر رساندن مقدار محصول در یک حجم معین در یک زمان خاص است.
کشت سلولی با تراکم بالا محققان را قادر به تولید مقدار زیادی از محصول با وزن خشک سلولی بالا و در نتیجه محصولی با غلظت بالاتر که نمیتوان آنها را در کشت های غیرمداوم متعارف و حتی فرآیندهای مداوم، تولید کنند و همچنین باعث می شود که سرمایه گذاری و هزینه های فرآیند به طور قابل ملاحظه ای کاهش یابد. این کاهش هزینه با توجه به کاهش در اندازه تجهیزات تخمیر، امکانات بالادستی از قبیل آب تصفیه شده و برق، بخار آب خالص، تامین هوای پاک و اتاق تمیز به دست می آید. اندازه واحدهای فرایند پایین دستی مانند سانتریفیوژ، میکرو و الترا فیلتراسیون و دستگاه تصفیه نیز کاهش می یابد.
تاکنون، به طور دقیق مقدار وزن خشک سلولی در هر لیتر که بتوان آن را به عنوان نمایندهی تراکم سلولی بالا در نظر گرفت، بدست نیامده است و مطالعات مختلف مقادیر مختلفی برای آن در نظر گرفته اند. مثلا موقعی که به 54گرم وزن خشک در هر لیتر از پروتوزئاها برسیم، گفته می شود که به کشت سلولی باتراکم بالا رسیه ایم در حالی که این مقدار برای باکتری ها و قارچ ها یک میزان متوسط در نظر گرفته می شود - چانگ و فوروساکی 1991، کی و تیدتکه - 1992 مثلا 50 گرم بر لیتر و یا حتی 20 گرم بر لیتر را به عنوان کشت با تراکم سلولی بالا در نظر گرفته اند.
نتایج و بحث:
در کشت سلولی با تراکم بالا مقادیر زیادی سوبسترا مورد نیاز است و تعداد زیادی سلول تولید میشود. برای دستیابی موفق به کشت سلولی با تراکم بالا و تولید پروتئین نوترکیب، باید محیط کشت، استراتژی خوراک دهی، و شرایط رشد را بهینه سازی کرد. - ترکیب محیط کشت هنگامی که باکتری به صورت کشت سلولی با تراکم کم در حال رشد است، تمام مواد مغذی مورد نیاز را میتوان در ابتدا در دسترس باکتری قرار دارد، اما در کشت سلولی با تراکم بالا مقادیر زیادی سوبسترا مورد نیاز است که تعداد زیادی سلول تولید شود اما این سوبستراها باید به شیوه ای کنترل شده به محیط افزوده شوند، زیرا افزوده شدن غیرکنترل شده ممکن است اثرات سوء ی بر رشد سلول ها و تولیدات آنها داشته باشد.
اگر منبع کربن و غیرکربنی موجود در محیط کشت بیش از حد باشد، منجر به تولید محصولات جانبی که اثر مهار کنندگی روی رشد دارند، می شوند و می توان با تغذیه یک منبع محدود کربن از آن جلوگیری می شود. محصولات فرعی متابولیک اصلی عبارتند از استات در E. coli، پروپیونات در B. subtilis، لاکتات در L. lactis و اتانول برای سرویزیه Riesenberg - S. cerevisiae و Guthke، . - 1999 نکته دیگر رسوب مواد تشکیل دهنده محیط کشت است، به ویژه هنگامی که آنها در غلظتهای بالا استفاده می شود و معمولا زمانی که سلولها با تراکم بالا در حال رشد هستند، دیده می شود.
تهنشینی زمانی اتفاق می افتد که ترکیبات غیرمحلول فلز آمونیوم فسفات دو ظرفیتی، منیزیم فسفات و دیگر فلزات فسفات - دین، - 1979 شکل گیرند. رسوب مواد می تواند مانع از رسیدن مواد مغذی کافی شده و بر عملیات بازیابی پایین دستی - downstream - ، عملیات تصفیه و مانیتورینگ تاثیر گذارد. برای مثال، رسوب نمک های معدنی که ممکن است در طول آماده سازی محیط کشت رخ دهد، از تعیین غلظت واقعی مواد معدنی در محیط کشت جلوگیری کرده و همچنین می توانید اندازه گیری تراکم سلول را مختل کند. Cereghino - و همکاران، - 2002
یکی دیگر از نگرانی، فشار اسمزی و هدایت - conductivity - ناشی از غلظت یون بالا در محیط رشد است که ممکن است روی پتانسیل غشا تاثیر گذارد و یا باعث ایجاد استرس های مختلفی که موجب کاهش سرعت رشد و یا توقف چرخه رشد شود Winzer - و همکاران، . - 2002 به طور کلی، محیط کشت های معین و تعریف شده ای برای به دست آوردن کشت سلولی با تراکم بالا استفاده می شود، زیرا غلظت مواد مغذی موجود در این محیط کشت ها، شناخته شده و معین بوده و در زمان رشد نیز قابل کنترل است.
محیط کشت های پیچیده ای مانند پپتون و عصاره مخمر می تواند از لحاظ ترکیب و کیفیت متفاوت باشند. با این حال، گاهی اوقات محیط کشت های نیمه شناخته شده و یا پیچیده، تولید محصول را افزایش داده است. استفاده از یک محیط کشت تعریف شده با یک یا چند اسیدهای آمینه برای رسیدن به تعداد سلول بالاتر و یا پروتئین نوترکیب بیشتر در صنعتی جذابیت زیادی دارد.
- شرایط فیزیکی دما:
برای کشت سلولی با تراکم بالا، کنترل دما به دلیل این که انتقال حرارت به دلیل ویسکوزیته بسیار بالا محدود می شود، مهم است. دما باید رشد سلول و همچنین تشکیل محصول را پشتیبانی کند. از آنجا که در بسیاری از فرآیندهای تخمیر، فاز رشد از فاز تولید جدا است، درجه حرارت باید برای هر فاز بهینه سازی شود. گزارش شده است که دما بر روی پایداری پلاسمید و در نتیجه عملکرد تولید پروتئین تاثیر می گذارد - داناوان و همکاران، . - 1996 همچنین نشان داده شده است که سرعت تخریب mRNA واکنش مرتبه اول است و افزایش درجه حرارت سبب افزایش تخریب می شود. بنابراین ممکن است که کاهش دمای کشت بتواند یک راه ساده و یک روش بالقوه مهم برای افزایش تولید پروتئین باشد - شین و همکاران، . - 1997
اکسیژن:
در کشت سلولی با تراکم بالا، باید ظرفیت بالایی از اکسیژن تامین شود. اکسیژن اغلب به دلیل حلالیت پایین خود، به عنوان یک عامل محدود کننده در HCDC ها تبدیل می شود. غلظت اکسیژن محلول اشباع - DO - در آب در دمای 25 C و فشار 1 اتمسفر تقریبا 7 میلی گرم در هر لیتر است، اما تامین اکسیژن را می توان با افزایش سرعت هوادهی یا هم زدن افزایش داد - لی، . - 1996 همچنین هوای غنی شده از اکسیژن یا اکسیژن خالص می تواند برای جلوگیری از محدودیت اکسیژن می تواند مورد استفاده قرار گیرد. میتوان سلولها را در شرایط تحت فشار برای افزایش انتقال اکسیژن، کشت داد.
افزایش ظرفیت انتقال اکسیژن در بیوراکتور، ممکن است سبب رسیدن به تولیدات سلولی بیشتر و غلظت نهایی زیست توده شود، زیرا محدودیت اکسیژن سبب شکل گیری متابولیت هایی مانند سوکسینات، استات، لاکتات، اتانول و هیدروژن می شوند که نامطلوب بوده و سبب کاهش بهره وری از بیوراکتور می شود Castan - و همکاران، 2002؛ Enfors و همکاران، . - 2001 با این حال، هنگامی که هوا با اکسیژن غنی می شود یا اکسیژن خالص برای رسیدن به نرخ خوراک بالا استفاده می شود، تاثیر غلظت بالای اکسیژن در بهره وری و تولید کیفیت پروتئین های نوترکیب باید مورد مطالعه قرار گیرد. همچنین باید در نظر گرفته شود که اکسیژن خود به طور بالقوه برای برخی از میکروارگانیسم ها سمی است.
کربن دی اکسید:
کربن دی اکسید می تواند رشد سلول ها و تولید پروتئین نوترکیب به ویژه در تراکم سلولی بالا را تحت تاثیر قرار دهد - لی، . - 1996 خوراک دادن با سوبسترای محدود کننده و با سرعت بالا، باعث تولید دی اکسید کربن با سرعت بالا و در نتیجه تولید مقدار زیادی دی اکسید کربن در راکتور می شود. غلظت دی اکسید کربن حل شده با توجه به قانون هنری، بستگی به فشار جزئی دی اکسید کربن دارد.
دی اکسید کربن دارای اثر سمی و جلوگیری کنندگی از رشد دارد. فشار جزیی زیاد CO2 - بالاتر از 0.3 اتمسفر - سرعت رشد را کاهش می دهد و سبب تحریک تشکیل استات می شود - لی، . - 1996 بنابراین، محیط کشت تحت فشار که برای افزایش انتقال اکسیژن نیز ممکن است مورد استفاده قرار گیرد، اثرات مضر CO2 را افزایش می دهد . - Matsui et al., 2006 -
Mixing - اختلاط - :
کم شدن بهره وری اختلاط راکتور به دلیل ویسکوزیته بالا، یکی دیگر از محدودیت های فیزیکی HCDC است. این مشکل با افزایش حجم راکتور تشدید می شود - لی، . - 1996 در بیوراکتور های بزرگ، نوسانات در غلظت سوبسترای محدود کننده، هم زدن را با مشکل روبرو می کند. در این فرآیند، مناطقی با غلظت سوبسترای بالا و پایین تشکیل می شود. در مناطق با غلظت بالا ممکن است سلول ها، محصولات جانبی سمی تولید کنند و این مناطق مستعد ایجاد محدودیت اکسیژن هستند، اما سلول هایی که در مناطق با غلظت کم قرار می گیرند، ممکن است دچار گرسنگی شوند.
مشکل دیگری که در ارتباط با این وضعیت وجود دارد، این است که سلول ها با یک استرس تحمیلی روبرو می شوند زیرا به طور مداوم از مناطق با غلظت سوبسترا بالا و پایین عبور می کنند. افزایش سرعت اختلاط راه حل اصلی برای حل کردن این مشکلات است، این روش می تواند تشکیل پروتئین و ضریب انتقال حجمی اکسیژن را بالا ببرد - ژانگ و همکاران، 2005؛ نمایید و همکاران، - .1998 اما ممکن است اثرات مضر بر روی سلول داشته باشد. انفورس و همکاران برای حل آن ها پیشنهاد دادند که تغذیه در چند نقطه از راکتور انجام شود و غلظت خوراک نیز کاهش داده شود - انفورس و همکاران . - 2001
کف:
تشکیل کف ممکن است باعث ایجاد مشکلات عملیاتی جدی در هوادهی بیوراکتورهای همزن دار شود. علت اصلی تشکیل کف، وجود پروتئین در محیط کشت است. این پروتئین ها در تماس با هوا از حالت طبیعی خارج شده و تشکیل کف می دهند، بنابراین این مشکل در کشت های سلولی با تراکم بالا برای تولید پروتئین نوترکیب بیشتر دیده می شود.
از آنجا که با افزایش تراکم سلول، تجزیه سلولی و در نتیجه غلظت پروتئین در محیط کشت افزایش می یابد، بنابراین تشکیل کف نیز افزایش می یابد. روش های مختلفی در صنعت برای کاهش سرعت تشکیل کف مورد استفاده قرار می گیرد که هر یک از آن ها دارای مزایا و معایب خاص خود هستند، از جمله معایب مواد ضد کف می توان به حلالیت کم آن ها که سبب کاهش هوادهی می شود - تا حدود 50 درصد - ، اشاره کرد. بنابراین از بین بردن کف با همزدن که یک روش مکانیکی است، یک روش جدید برای کاهش کف در فرآیند تخمیر است.
