بخشی از مقاله
چکیده :
گیاهان گنجینه شیمیایی تکامل یافته ای هستند که نقش اساسی در تداوم زندگی دارند . در حال حاضر هزاران مواد شیمیایی مشتق شده از گیاهان مورد بهره برداری انسان قرار می گیرد .باید توجه داشت، با ارزش ترین محصولات طبیعی گیاهی NPs ، - - NATURAL PRODUCTS در گونه های گیاهی وحشی وجود داشته و در سطح زراعی تولید آنها میسر نیست .
علاوه بر این ، این گونه های گیاهی اغلب دارای رشد کندی در جمعیتهای محدود می باشند . غلظت ماده مولکولی مورد نظر ، بسیار متغیر و بطور معمول در غلظتهای کم مشاهده می شود . سلولهای و اندامهای گیاهی قابل کشت به منزله یک ابزار پایدار و قابل کنترل و دوست دار محیط زیست برای تولید صنعتی محصولات طبیعی گیاهی - - NPs می باشند.
با پیشرفتهای علمی و تکنیکی در انتخاب نوع سلول جهت بیو ترانسفور ماسیون ، ماده مترشحه ، نفوذ ناپذیری سلول ، استخراج در مقیاس بالا و افزایش بازدهی محصول طبیعی گیاهی ممکن گردیده است . با این وجود ، موانع قابل توجه ای در تولید تجاری مواد با ارزش از منابع گیاهی وجود دارد . اخیرا ، شناسایی ، جداسازی و کشت سلولهای مریستمی - CMCs - بنام کشت ریشه های مویین ، دارای ارزش تجاری ، با یک روش کاربردی جدید برای از بین بردن مشکلات بالقوه که در استخراج محصولات NP وجود دارد ، با استفاده از بیو راکتور های گیاهی ابداع گردیده است .
مقدمه :
گیاهان گنجینه شیمیایی با ارزش و تکامل یافته می باشند و ابتداء باید برای بقاء بتوانند خود را در برابر عوامل بیماریزای میکروبی و غیر میکروبی و آفات و حیوانات گوناگون حفظ نمایند . تا به امروز قریب به 200000 محصول طبیعی گیاهی ، شناسایی شده اند که برخی از آنها مانند کدئین ، مورفین و تاکسل به عنوان دارو و برخی مانند زعفران ، نعناع، و آنتوسیانین به عنوان طعم دهنده غذایی و بعضی دیگر بعنوان آفت کش در مبارزه شیمیایی با عوامل پاتوژن مثل نیکوتین ، استریکنین و آزادیراکتین و همچنین برخی در لوازم آرایشی و بهداشتی مثل اسطوخودوس ، رزماری و آلوورا استفاده می شوند . داروهای پر مصرفی نظیر تاکسول ، آسپرین و دیجیتوکسین فقط از طریق منابع گیاهی بدست می آیند
یک اصل پذیرفته شده برای تولید محصولات طبیعی از منابع گیاهی - NPs - NATURAL PRODUCTS این است که تولید اکثر محصولات از طریق زراعی مقدور نبوده و بسیاری از این مواد با ارزش در جمعیتهای غیر زراعی و وحشی وجود دارد که این موضوع به عنوان یک محدودیت در این راستا شناخته می شود . همچنین رشد کند گونه های وحشی ، باعث کاهش فراوانی و کاهش پتانسیل تولید محصولات NP در منابع گیاهی می شود [2] تولید NPs ها از طریق نیمه صناعی ، نشان داد که از این راه هم می توان برخی مواد شیمیایی را از میان انبوه مواد طبیعی گیاهی تولید کرد .
این روش بر پایه تولید زیادتر و کامل تر یک پیش ماده در مسیر بیوسنتز ماده شیمایی مورد نظر هست که در نهایت منجر به تولید ماده نهایی خواهد شد . برای مثال می توان تولید دی ترپنوئید و تاکسل را نام برد که از طریق مسیرهای نیمه سنتتیک به دست آمده اند . کشت سلول گیاهی - Plant Cell Culture PCC - تکنولوژی ایده آل برای تولید NPs است .
این فن آوری دارای چند مزیت در مقایسه با سایر روشها بخصوص برای تولید NPs های با ساختار پیچیده می باشد . به تازگی پیشرفتهای قابل توجه ای در روشهای کشت سلولهای گیاهی بدست آمده است . توسعه فن آوری های جدید و قدرتمند اومیکس ، مثل توانایی تعیین توالی نسل بعدی گونه ، فرصتهای خوبی برای کشت سلولهای گیاهی فراهم کرد .
کشت سلول گیاهی :
کشت سلول گیاهی - - PCC ، یک روش کاربردی بسیار ایده آل برای تهیه NPs ها می باشد که در صنایع غذایی ، مواد آرایشی و بهداشتی و دارویی کاربرد دارند . کشت بافت و سلول گیاهی به روشی گفته می شود که اجزای مختلف گیاه - سلول ، پروتوپلاست ، جنین ، بافت ، اندام و ... - در شرایط آزمایشگاهی و بطور کاملا استریل روی یک محیط کشت قرار می گیرند و در شرایط محیطی مناسب نگهداری می شوند . اولین آزمایشهای کشت بافت و سلول گیاهی توسط گوتلیب هابرلند در سال 1889 میلادی انجام شد
این روش ابزار مهمی برای تحقیقات در مورد تولید محصولات NPs با ارزش نیز می باشد . تولید NPs با روش PCC دارای مزایای قابل توجه ای نسبت به تولید از طریق برداشت عادی و نیمه صناعی می باشد . پیش ماده طبیعی فراوانی که از طریق PCC تولید می شود ، یک سیستم تولیدی قوی برای NPs ها ، جدای از مشکل محدودیت حاصل از تنوع جغرافیایی و شرابط فصلی ایجاد می کند و محدودیتهای ناشی از غیر قابل دسترس بودن گونه های گیاهی وحشی کمیاب و در حال انقراض را مرتفع می کند .
استفاده از این فن آوری نیاز به منابع آبی ارزشمند را که در ارتباط مستقیم با سیستم تولید محصولات کشاورزی می باشد را کاهش می دهد . [2] کشت سوسپانسیونی سلولهای گیاهی ، اغلب قابل اعتماد تر و مولد تر می باشند . برای مثال ، تولید ژرانیول که یک مونوترپنوئید قابل استفاده جهت عطر و طعم در صنایع می باشد را می توان عنوان کرد که این ماده در سطح مقدار تولید بیشتر در گیاه تراریخته توتون انجام شده است ، ولی اثبات گردید که تولید آن از طریق PCC مقرون به صرفه تر از نظر هزینه و مدت زمان تولید و سادگی حمل ونقل بوده و ماهیت فرآیند تولید نیز در این روش مستمر می باشد .
همچنین با استفاده از یک محیط کشت مناسب و با سطح هورمونی مطلوب ، امکان تولید محصولات NP در کشت آزمایشگاهی ، برای بیشتر گونه های گیاهی امکان پذیر است . با تهیه یک کالوس خوب ، به سادگی با اضافه کردن سلولها به محیط کشت مایع ، می توان کشت سوسپانسیونی سلول ایجاد کرد ، که نسبت به کشتهای معمولی قابلیت بیشتری برای رشد داشته و می تواند از طریق بیوراکتورهای صنعتی منجر به تولید NPs ها در سطوح بسیار زیاد گردد
کشت ریشه های مویین :
کشت سلولهای تمایزیافته از بافتهای گیاهی مانند ریشه ها و شاخه ها ، یک روش جایگزین برای تولید NPs های با ارزش بالا می باشد . کشت ریشه های مویین از طریق آلوده شدن با میکروب گرم منفی خاکزی آگرو باکتریوم ریزوژنز ، که T-DNA را از پلاسمید RI به داخل ژنوم گیاه انتقال می دهد ، انجام می گیرد . T-DNA حامل یک مجموعه از ژنهایی است که ترشح اکسین و سیتوکنین را کنترل می کنند و عامل برهم زدن تنظیم هورمونهای اکسین و سیتوکنین در محل عفونت می باشد که بصورت فعال در محیط سلول بیان می گردد و باعث تحریک و تکثیر ریشه می شوند که اصطلاحا به آن ریشه مویین می گویند . کشت ریشه مویین معمولا با حفاظت و ثبات ژنتیکی همراه است . کشت ریشه مویین در تولید طیف گسترده ای از محصولات NPs از قبیل نیکوتینها ، جین سینوزیدها ، کامپتوجسین ، تروپان و آلکالوئیدهای پیرولیزیدین با موفقیت همراه بوده است
ولی محدودیت مهم در تولید NPs از این طریق این است که ماده مورد نظر باید قابلیت تولید در ریشه را داشته باشد که باید اذعان داشت تعداد بسیار کمی از NPs ها در ریشه سنتز می شوند و اکثر مواد در اندامهای هوایی تولید می گردند . مشکل بالقوه دیگر این است که بسیاری از موادی که در ریشه تولید می شوند ، توسط آوندها به سایر اندامها منتقل و در جایی دور از محل تولید جهت دفاع شیمیایی گیاه در برابر تنشها ذخیره می گردند . با این وجود تعدادی از NPs های سنتز شده در ریشه ذخیره می شوند . مثل اسکوپولامین ، آتروپین ، آنتراکینون ، ایندول و آلکالوئیدهای گلیکوزیدی قلبی که در ریشه وجود دارند .
یکی دیگر از محدودیتهای عمده برای تولید NPs بصورت صنعتی از طریق کشت ریشه های مویین ، سیستم مناسب تولید توسط بیوراکتورهای زیستی می باشد . تحولات اخیر در مهندسی فرآیندهای زیستی ، باعث ساخت بیوراکتورهای سازگار با سیستم ریشه های مویین شد . صنایع ROOTEC یک نوع بیوراکتور برای تولید تعدادی از NPs ها از گونه های گیاهی تولید نموده است . [2] - WWW.rootec. co. - تولید NPs ها ،از طریق کشت مویین با توجه به مزیت رشد معمولی در محیطهای کشت ساده و ثبات ژنتیکی و ظرفیت تولید در مقیاس زیاد ، برای تولید پروتیین های دارویی نیز مورد توجه قرار گرفته است .
انتخاب لاین سلولی برای افزایش تولید : NP
با توجه به جمعیت ناهمگن سلولهای تمایز نیافته معمولی - Dedifferentiated Cells Callus - DCCs انتخاب یک لاین سلولی بسیار مولد از کالوس ، یک گام ضروری برای تولید موفق NPs می باشد . کالوس تمایز نیافته گیاه را می توان در محیط کشت مایع ، پراکنده کرد و بطور مداوم در یک محیط استریل و تحت کنترل تکثیر کرد . [4] تجمع NPs در گیاهان مختلف با ژنوتیپهای خاص همراه است و انتخاب گونه مناسب و اندام مناسب برای تولید کالوس کار بسیار مهمی است .
فرآیند انتخاب را می توان با روشهای مبتنی بر مواد شیمیایی خاص تسهیل کرد . شناسایی لاینهای سلولی که سطوح بالای ترشح متابولیکی را نشان می دهند ، از طریق مشخص کردن مسیر ، توسط مواد واسط برون سلولی امکان پذیر می باشد . به عنوان مثال ،لاین سلولی جهت افزایش رزماریک اسید در گیاه اسطوخودوس با اضافه کردن دو ماده مختلف فنل آلانینی - m- and p-F-D,L phenylalanine - به محیط کشت ، پیش ماده فنیل آلانین آمونیا لیاز - - PAL تولید می کند . . [2] که فقط در حضور این دو ماده و مواد مشابه ، لاین سلولی قادر به تولید سطح بالای رزماریک اسید می باشد .
محدودیت عمده برای انتخاب یک لاین سلولی مناسب جهت تولید NP این است که اغلب لاینهای سلولی توانایی تولید NP مورد نظر را از دست می دهند . کاهش یا از دست دادن توانایی تولید NP می تواند به دلیل بی ثباتی ژنتیکی ناشی از تنوع سومکلونالی باشد . در کشت سلولی گیاه سرخدار، پس از یک دوره یکساله کشت ، تغییرات پلوئیدی درنسلهای ایجاد شده با سلولهای حاوی DNA های مختلف مشاهده گردید که ظاهرا این تغییرات منجر به خاموشی ژن دربیان افزایش تعداد می گردد. شناسایی تغییرات عملکرد کشت به منظور پیشگیری اثرات مخرب این تغییرات مستلزم غربالگری دوره ای به منظور حفظ ویژگی مطلوب در سیستمهای کشت می باشد .
بهینه سازی محیط کشت :
به دنبال انتخاب لاینهای سلولی که نقش زیادی در کشت سلولی دارند ، بهینه سازی تولید وشرایط رشد و نگهداری محیط کشت امری ضروری برای دست یابی به محصولات NP در مقیاس زیاد است . تعیین استاندارد متوسط PCC در محیطهای کشت مثل SH, MS ، گامبرگ B5 و LS یک راهبرد عملی برای دست یابی به شرایط رشد و نگهداری بهینه لاینهای سلولی ارائه می دهد . بهینه سازی محیطهای کشت اولیه با مزایای قابل توجه کوتاه شدن زمان تولید ، یکپارچگی و ثبات NPs خاصی که قرار است تولید شود ، همراه است . بعضی از اصلاحات مفیدی که در محیط کشت برای بالا بردن کیفیت NP تولید شده اعمال می شود ، به منابع انرژی ، نیتروژن ، فسفات ، هورمونهای گیاهی و تراکم ماده تلقیحی ، وابسته هستند . NPs ها معمولا در اواخر فاز ثابت رشد با مهار آنزیم برای سوخت و ساز ثانویه تولید می شوند
