بخشی از مقاله
چکیده:
سالمونلاها گروهی از باکتریهاي میله اي شکل، گرم منفی از خانوادة انتروباکتریاسه هستند که بیماریهاي عفونی در انسان و حیوانات ایجاد می کنند. سالمونلا یکی از مهمترین باکتریهاي بیماریزاست که عامل تب تیفوئید، سالمونلوز و برخی انواع دیگربیماریهاي عفونی در انسان و حیوان است که یک مشکل بهداشتی بزرگ بخصوص در کشورهاي در حال توسعه است. OmpA یکی از پروتئینهاي غشاء خارجی خانوادة انتروباکتریاسه است که 325 اسید آمینه دارد و قادر است سیستم ایمنی میزبان وتولید آنتی بادي اختصاصی ضد این پروتئین را تحریک کند.
در این کار ما ژنوم سالمونلا تیفی موریوم را استخراج و ژن OmpA را با استفاده از پرایمرهاي اختصاصی تکثیر کردیم. محصول PCR بدست آمده در وکتور کلونینگ - pTZ57R/T cloning vector - TA قرار داده شد و ترانسفورماسیون میزبان - E.coli TG1 - به روش الکتروپوریشن انجام شد. حضور ژن OmpA در باکتریهاي ترانسفورم شده بررسی شد وبراي تأیید صحت ژن توالی کلون شده، نمونه تعیین توالی شد. بعد از تأیید توالی در کلونینگ اولیه، ژن OmpA در وکتور بیانی اختصاصی لاکتوباسیل ساب کلون شد. حضور ژن در باکتري گرم مثبت - لاکتوباسیل - با PCR و تعیین توالی ژن انتقالی تĤیید شد.
مقدمه:
کاربرد باکتریها به عنوان ابزاري براي انتقال ژن به منظور ایمن سازي جانداران یکی از مباحث جالب و مورد توجه در بین محققین علوم پزشکی است. باکتریهاي اسید لاکتیک که به طور گسترده اي در صنایع غذایی استفاده می شوند جزئی از فلور نرمال بدن جانداران از جمله انسان هستند به همین دلیل استفاده از این باکتریها براي تولید پروتئینهاي هترولوگ بسیار مورد توجه است.
سالمونلا یک باکتري گرم منفی از خانوادة انتروباکتریاسه و از پاتوژنهاي بسیار مهم است که باعث تب تیفوئید، سالمونلوز و انواع دیگر بیماریهاي عفونی در انسان و حیوان می شود، سالمونلا تیفی موریم یک از اعضاي این خانواده است که عامل بیشتر مسمومیتهاي غذایی است که توسط خانوادة سالمونلا ایجاد می شود و سالیانه خسارات اقتصادي فراوانی به ویژه درحوزة بهداشت و درمان به دولتها به خصوص در کشورهاي در حال توسعه وارد می کند. - - 1 OmpA یکی از پروتئینهاي غشاء خارجی در سالمونلا است که 325 اسدآمینه دارد و قادرست سیستم ایمنی میزبان را تحریک و باعث تولید آنتی بادي اختصاصی شود. - 4،3، - 2 پاسخ ایمنی ضد سالمونلا و اثر حفاظتی موثر ناشی از ایمن شدن با پروتئینهاي غشاء خارجی سالمونلا توسط پژوهشگران مختلفی گزارش شده است.
باکتریهایی که به طور طبیعی ساکن روده هستند نه تنها به علت بی خطر بودن براي میزبان، مناسب استفاده براي انتقال ژن هستند بلکه به علت قابلیت چسبیدن به جدار روده و ماندگاري در محیط روده تا زمانی که زنده هستند می توانند آنتی ژن را تولید کنند. آنها مانند واکسن مخاطی البته با مدت اثر طولانی، عمل می کنند. چنین واکسنی نیاز به دوز یادآور نداشته و می تواند براي تمام عمر کافی و موثر باشد.
مواد و روشها:
باکتري سالمونلا تیفی موریوم در محیط LB مایع کشت داده شد. بعد از 18 ساعت انکوباسیون در دماي 37º با دور 3700 و دماي 4º به مدت 20 دقیقه سانتریفوژ، رسوب باکتري براي استخراج DNA با کیت تخلیص ژنوم استفاده شد. روي ژنوم تخلیص شده PCR با پرایمرهاي اختصاصی ویژة تکثیر OmpA گذاشته شد. بعد از الکتروفورز محصول PCR روي آگاروز%2 باند 1400 bp که مربوط به OmpA است، بریده و تخلیص شد. در مرحله بعد محصول PCR در وکتور کلونینک - pTZ57R/T cloning vector - T/A کلون شد. ترانسفورماسیون میزبان - E.coli TG1 - به روش الکتروپوریشن انجام شد.
براي تایید حضور پلاسمید حاوي ژن در باکتري بعد از انکوباسیون 16 ساعته محصول الکتروپوریشن، روي کلونیهاي رشد کرده در پلیت آنتی بیوتیکی PCR گذاشته شد. کلونهایی که در PCR باند 1400 bp ژن را داشتند، انتخاب و براي تخلیص پلاسمید کشت داده شدند. پلاسمید حاصل از تخلیص براي تعیین توالی و تایید ژن فرستاده شد.
بعد از تایید توالی ، ژن کلون شده در وکتور کلونینگT/A در وکتور اختصاصی بیانی لاکتوباسیل - - K-NR ساب کلون شد. در مرحله بعد وکتور بیانی حاوي ژن براي ترانسفوماسیون باکتري میزبان - لاکتوباسیل - استفاده شد. بعد از الکتروپوریشن و انکوباسیون، کلونهاي مقاوم به آنتی بیوتیک لاکتوباسیل براي استخراج پلاسمید کشت داده شدند، پلاسمید استخراج شده بعد از PCR و وجود باند 1400 bp ، براي تعیین توالی و تأیید نهایی فرستاده شد.
نتایج و بحث:
ژن OmpA تکثیر شده در وکتور T/A کلون شد، کلونهاي مقاوم به آنتی بیوتیک براي کلونیPCR با پرایمرهاي اختصاصی ژن انتخاب شدند. - شکل - 1 تخلیص پلاسمید از کلونهایی که باند 1400 bp را داشتند انجام شد و مجددا براي چک کردن حضور ژن، این بار PCR روي پلاسمید تخلیص شده تکرار شد. نتیجه تعیین توالی نمونه پلاسمید با جوابPCR مثبت بعد از مقایسه با توالیهاي موجود در بانک ژنی تایید کنندة کلونینگ موفقیت آمیز ompA سالمونلا تیفی موریوم بود.
ترانسفورماسیون لاکتوباسیل میزبان با وکتور بیانی ویژة لاکتوباسیل که ژن OmpA در آن قرار داده شده بود با موفقیت انجام شد وحضور ژن ompA در لاکتوباسیل به دنبال PCR و تعیین توالی ژن، تایید شد. بیان پروتئینهاي هترولوگ در باکتریها ار موضوعات مورد توجه در بیوتکنولوژي است، از باکتریهاي اسید لاکتیک در این رابطه استفاده هاي زیادي شده است.
در این کار ژن OmpA سالمونلا تیفی موریوم در لاکتوباسیل کلون شد. این پروتئین یکی از پروتئینهاي بزرگ غشاء خارجی در سالمونلاست. OmpA مانند پورینها - پروتئینهاي کانالی غشاء - و لیپوپلی ساکاریدهاي - - LPS غشاء باکتري مورد شناسایی دستگاه ایمنی بدن جاندار قرار می گیرد. 8 - ،7،6، - 5 در این مطالعه کلون کردن ژن OmpA به عنوان گامی نو براي پیشگیري از سالمونلوز و بیان پروتئینهاي هترولوگ در میزبانهاي لاکتوباسیلی انجام شد.
