پاورپوینت نگهداری و استفاده از سویه های باکتریایی

بخشی از پاورپوینت

اسلاید 1 :

نگهداری و استفاده از سویه های باکتریایی

اسلاید 2 :

هدف
ذخیره کردن باکتری ها به روش مناسب و استفاده از آنها برای مقاصد مختلف
روش مناسب
روشی است که باکتری بتواند در آن شرایط زنده مانده، در ضمن ویژگی هایش حفظ شود و پایدار بماند.
مقاصد مختلف
برنامه تضمین کیفیت، مانند ارزیابی کیفی محیط های کشت، معرف ها، دیسک های آنتی بیوتیک و .
انجام آزمایش های تاییدی یا تکمیلی مانند بررسی الگوی مقاومتی با آزمایش تعیین حساسیت ضد میکروبی، بررسی های اپیدمیولوژی و .

اسلاید 3 :

تعاریف
Reference Culture (کشت مرجع)
میکروارگانیسمی که از یک کلکسیون میکروبی معتبر تهیه می شود.
Reference Stock Culture (کشت ذخیره مرجع)
میکروارگانیسمی که از یک کشت مرجع تهیه می شود. دستورالعمل و استانداردهایی وجود دارد که روش کار و ذخیره کردن آنها را شرح می دهد.
Working Stock Cultures (کشت ذخیره کاری)
کشتی که از یک کشت ذخیره مرجع بدست می آید. دستورالعمل و استانداردهایی وجود دارد که روش کار و نحوه پاساژ دادن آنها را شرح می دهد.
Subcultures (Passages)
انتقال (کشت) یک میکروارگانیسم از محیط کشت به محیط کشت جدید دیگر. به میکروارگانیسم رشد یافته روی محیط جدید Subculture یا پاساژ گفته می شود.
اما به میکروارگانیسم رشد یافته از کشت مرجع یا کشت ذخیره مرجع (بصورت لیوفیلیزه یا فریز شده) Subculture گفته نمی شود.
Working Control Culture (کشت کنترل کاری)
کشت مجدد از کشت ذخيره کاری که براي ارزیابی کیفی محیط کشت و . استفاده ميشود.

اسلاید 4 :

منابع تهیه میکروارگانیسم های کنترل کیفی
American Type Culture Collection (ATCC®)، از منابع تجاری (برای ارزیابی کیفی دیسک های آنتی بیوتیکی یا E-Test باید از سویه های ATCC استفاده نمود.)
میکروارگانیسم هایی که از بیمار جدا شده اند، قبلا خصوصیات آنها مشخص شده و از نظر ویژگی های فنوتیپی پایدار باشند. خصوصیات بیوشیمیایی اینها باید ثبت و نگهداری شود. (از این میکروارگانیسم ها تنها می توان برای ارزیابی کیفیت محیط های کشت یا معرف ها استفاده نمود.)
آزمایشگاه مرجع سلامت
نمونه های ارزیابی خارجی کیفیت (EQAS) ارسال شده از جانب مراکز معتبر و مورد تایید آزمایشگاه مرجع سلامت

اسلاید 5 :

نگهداری سویه های باکتریایی
نگهداری به روش های طولانی مدت (یک سال یا بیشتر)
نگهداری به روش های کوتاه مدت (کمتر از یک سال)

اسلاید 6 :

نگهداری به روش های طولانی مدت
نگهداري طولاني مدت باکتريها اين امکان را ميدهد که کليه سويههاي ميکروبي اعم از هوازي (با رشد سريع و يا سخت رشد) ونيز بيهوازي، ماهها و حتي سالها به صورت زنده نگهداري شوند.
بهترين روشهاي نگهداري طولاني مدت
ليوفيليزاسيون (Freeze drying)
نگهداري در ۷۰- درجه سانتيگراد ( در دیپ فریز Ultra Low Freezer)
نگهداری در ۱۹۶- درجه سانتیگراد (در ازت مايع )
نگهداري در دماي اتاق با كشت در محيط TSA (tryptic soy agar)
نگهداري در دماي اتاق با كشت در محيط BHIA (brain heart infusion agar)

اسلاید 7 :

نگهداري در دیپ فریز (Ultra Low Freezer) یا ازت مایع
باکتري مورد نظر را روي محيط مغذي مانند پليت TSA ( Trypticase Soy Agar ) حاوي 5% خون گوسفند و در مورد ميکروارگانيسمهاي سخت رشد روي محيط شکلات آگار کشت دهيد.
پليتها را به مدت 24-18 ساعت در دماي 1±36 درجه سانتيگراد و در صورت نياز تحت شرايطCO2 براي هر باکتري انکوبه نمائيد.
بعد از انکوباسيون، خالص بودن و مورفولوژي کلنيها را بررسي نموده و در صورت نياز، تستهاي بيوشيميايي انجام دهيد.
سپس از باکتري رشد يافته، سوسپانسيون غليظي در 100-50 ميليليتر از يک محيط محافظتکننده از سرما (Cryoprotective ) تهيه نمائيد. اين محيط براي جلوگيري از تخريب سلولهاي باکتري در شرايط انجماد مورد استفاده قرار ميگيرد. محيط محافظتکننده از سرما شامل:
Skim milk
خون گوسفند يا خرگوش دفيبرينه استريل
50% fetal calf serum in broth
Tryptic Soy Broth (TSB) حاوي گليسرول با غلظت نهايي 15-10%

اسلاید 8 :

نگهداري در دیپ فریزUltra Low Freezer) ) یا ازت مایع
سپس از سوسپانسيون باکتريايي فوق به مقدار ml۰.۵-۱ در ويالهاي شيشهاي يا پلاستيکي کوچک استريل توزيع کنيد. تعداد ويال ذخيره را براي مصرف يکسال آماده نمائيد.
ويالهاي حاوي سويهها را ميتوان در برودت 50- تا 70- درجه سانتيگراد به مدت طولاني نگهداري نمود.
در صورت عدم دسترسي به فريزر 70- درجه مي توان سويهها را در فريزر 20- درجه نيز نگهداري نمود. در اين شرايط توجه به این نکته ضروري است:
سويههاي باكتريايي در اين برودت عمر کمتری (حداكثر يكسال) دارند وممكن است تعداد زيادي از سلولها از بين بروند.
توصيه ميشود براي اطمينان از زنده بودن سويهها در فواصل هر چند ماه، از روی کشت ذخیره کاری فریز شده، یک کشت جدید بر روی محیط مناسب تهيه شود.

اسلاید 9 :

استفاده از سویه های فریز شده
يک ويال از فريزر بيرون آورده و سريعا زير آب جاری ولرم محتويات آنرا ذوب نمائيد.
سویه را روي محيط آگار خوندار يا شکلاته ( در مورد باکتريهاي سخت رشد ) تلقيح کرده و به مدت ۱۸-۲۴ ساعت در دماي ۳۶±۱ درجه و در صورت نياز در شرايط CO2 انکوبه نماييد (ساب کالچر اوليه یا F1).
قبل از استفاده برای آزمايش، از کشت ذخيره فريز شده، دو بار ساب کالچر انجام دهيد.(F1 & F2)
پليت ها را در دمای c º۲-۸ در مورد ارگانيسم های غير سخت رشد (يا شرايط مناسب برای هر نوع ميکروارگانيسم) نگهداری نماييد.

• توجه 1 : ويال ذخيره مورد استفاده، بعد از ذوب شدن بايد دور انداخته شود و نبايد مجدداً فريز گردد.
• توجه 2 : قبل از استفاده از سويه رشد يافته روی هر پليت بايد از خالص بودن سويه، اطمينان حاصل نمود.
• توجه 3 : از کشت ذخيره فريز شده حداکثر تا 3 پاساژ پشت سر هم ميتوان انجام داد. پس از آن، پليت بايد دور انداخته شود
و از يک کشت ذخيره فريز شده ديگر استفاده گردد. پاساژهای پشت سر هم مکرر )بيش از 3 پاساژ(، احتمال تغيير فنوتيپي سويه ها را افزايش ميدهد.

اسلاید 12 :

نگهداري در دماي اتاق با كشت در محيط TSA /BHIA
محيط کشت Brain Heart Infusion Agar (BHIA) را با شيب کم در لوله تهيه نماييد.
براي باکتريهاي سخت رشد مانند گونوکک، مننگوکک، استرپتوکک پنومونيه و هموفيلوس آنفلوانزا، لازم است از محيط شکلات آگار استفاده شود. (با افزودن 5% خون گوسفند به محيط فوق پس از خروج از اتوکلاو و رسيدن به دمای 50 درجه سانتیگراد و قرار دادن در بنماري 80 درجه سانتيگراد به مدت 15 دقيقه)
روغن معدني ( يا پارافين مايع ) را در حرارت خشک ( 170 درجه سانتيگراد به مدت يک ساعت ) استريل نمائيد.
باکتری مورد نظر را روی سطح محيط کشت دهيد و در شرايط مناسب برای هر ميکروارگانيسم انکوبه نماييد.
بعد از اطمينان از وجود رشد کافي، روغن استريل را به مقدار ml۱ روی سطح محيط بريزيد، به گونه ای که سطح شيبدار محيط را بپوشاند.
لوله ها را با رعايت شرايط ايمني در دمای اتاق نگهداری کنيد.
در صورت نياز به کشت مجدد سويه، با لوپ استريل از قسمت زيرين روغن برداشته و روی محيط آگار خوندار يا شکلاته کشت دهيد.
از لوله ذخيره بعد از 12 - 6 ماه تجديد کشت نماييد.

اسلاید 13 :

نگهداري در دماي اتاق با كشت در محيط TSA
اين روش فقط برای باکتری هايي که سخت رشد نيستند، مانند استافيلوکک و انتروباکترياسه به کار مي رود.
محيط کشت آگار بدون کربوهيدرات را با عمق زياد در لوله شيشه ای درپيچ دار تهيه کنيد. محيط Tryptic Soy Agar (TSA) پيشنهاد مي شود.
باکتری را به صورت کشت عمقي در اين محيط تلقيح کنيد.
محيط را به مدت 24-18 ساعت در دمای ۳۶±۱ درجه انکوبه نماييد.
سپس لوله درپيچ دار را در پارافين مذاب فرو ببريد، که کاملاً درِ لوله را بپوشاند.
لوله ها را با رعايت شرايط ايمني در دمای اتاق نگهداری کنيد.
از لوله ذخيره بعد از 12 - 6 ماه تجديد کشت نماييد.

اسلاید 14 :

نگهداری به روش های کوتاه مدت
كشت در TSA ( Tryptic Soy Agar) براي باكتري هاي با رشد سريع
باکتری مورد نظر را در سطح و عمق محيطTSA لوله ای درپيچ دار کشت دهيد.
محيط را به مدت 24 - 18 ساعت در دمای ۳۶±۱ درجه انکوبه نماييد.
پس از رشد کامل، لوله را در يخچال نگهداری کنيد.
هر 4 - 2 هفته يکبار تجديد کشت نماييد.
كشت در (Sheep Blood Agar ) آگار خوندار براي استرپتوكک ها
سويه مورد نظر را در سطح محيط آگار خوندار لوله ای درپيچ دار کشت دهيد.
محيط را به مدت 72 - 24 ساعت در دمای ۳۶±۱ درجه انکوبه نماييد.
پس از رشد کامل، لوله را در يخچال نگهداری کنيد.
هر دو هفته يکبار تجديد کشت نماييد. ( برای استرپتوکک پنومونيه، محيط را در دماي اتاق نگهداري کنيد.)

اسلاید 15 :

نگهداری به روش های کوتاه مدتکشت در محيط سيستين تريپتيکيس آگار (CTA) براي نيسريا و استرپتوکوک
محيط کشت(CTA) Cystine Tryptic Agar به اضافهmL ۱ سرم استريل اسب را با عمق زياد در لوله شيشه ای درپيچ دار تهيه کنيد.
سويه نيسريا يا استرپتوکک را به طور عمقي در اين محيط کشت دهيد.
محيط را به مدت 72 - 24 ساعت در دمای ۳۶±۱ درجه و CO2 5 % انکوبه نماييد.
سپس لوله درپيچ دار را در پارافين مذاب فرو ببريد، که کاملاً درِ لوله را بپوشاند.
برای نيسرياها لوله را در C º35 نگهداری کنيد و هر دو هفته يکبار تجديد کشت نماييد. برای استرپتوکک ها لوله را با رعايت شرايط ايمني در دمای اتاق نگهداری کرده و هر ماه تجديد کشت کنيد.c

اسلاید 16 :

نگهداری به روش های کوتاه مدت محيط کشت Cooked meat براي باکتريهاي بيهوازي
باکتري را در لولههاي حاوي محيط Cooked meat کشت دهيد.
محيط را به مدت 2418- ساعت در 35 درجه سانتيگراد تحت شرایط بی هوازی انکوبه نماييد.
محيط را به مدت 72 - 24 ساعت در دمای ۳۶±۱ درجه انکوبه نماييد.
در لوله را با چوبپنبه يا در پيچ ببنديد.
لوله ها را با رعايت شرايط ايمني در دمای اتاق نگهداری کنيد.
هر دو ماه يکبار تجديد کشت نماييد.

اسلاید 17 :

نگهداری به روش های کوتاه مدت
كشت در (Chocolate Agar) شکلات آگار براي مننگوكک و هموفيلوس
سويه مورد نظر را در سطح محيط شکلات آگار لوله ای يا پليتي کشت دهيد.
لوله يا پليت را به مدت 72 - 24 ساعت در ۳۶±۱ درجه انکوبه کنيد.
لوله يا پليت را بعد از رشد در حرارت اتاق نگهداری کنيد.
هر دو هفته يکبار تجديد کشت نماييد.
كشت درChocolate Agar براي گونوكک
سويه مورد نظر را در سطح محيط شکلات آگار پليتي يا شيبدار لوله ای کشت دهيد.
لوله يا پليت را به مدت 72 - 24 ساعت در ۳۶±۱ درجه انکوبه کنيد.
پس از اين مدت، لوله يا پليت را مجدداً در اين درجه حرارت ۳۶±۱ درجه نگهداری نماييد.
هر دو روز يکبار تجديد کشت کنيد.