بخشی از پاورپوینت
اسلاید 2 :
موضوع سمینار: انزیم لاکاز
نام درس:انزیمولوژی
اسلاید 3 :
چکیده
لاکاز متعلق به اکسیدازهای چند قطره آبی است و در اتصال متقابل مونومرها ، تخریب پلیمرها و شکاف حلقه ترکیبات معطر شرکت می کند. به طور گسترده در گیاهان و قارچهای بالاتر توزیع می شود. در آسكوميكس ، دوتروتوميكس و باسيديمايكس وجود دارد و در قارچ هاي پوسيدگي ليگنين ناسازگار بسيار زياد است. همچنین در سنتز ماده آلی مورد استفاده قرار می گیرد ، جایی که بسترهای معمولی آمین ها و فنل ها هستند ، محصولات واکنش دیمر و الیگومرهای حاصل از اتصال واسطه های رادیکال واکنشی هستند. در سالهای اخیر ، این آنزیم ها در زمینه منسوجات ، خمیر و کاغذ و صنایع غذایی کاربردهای بسیاری پیدا کرده اند. اخیراً نیز از آن در طراحی بیوسنسورها ، سلولهای سوخت زیستی ، به عنوان یک ابزار تشخیص پزشکی و ماده بیولوژیکی برای تمیز کردن علف کش ها ، سموم دفع آفات و مواد منفجره در خاک استفاده می شود.
اسلاید 4 :
لاكازها به دليل توانايي آنها در اکسيد كردن هر دو تركيبات مرتبط با فنوليك و غير فنوليك و همچنين آلاينده هاي محيط زيست بسيار حساس ، مورد توجه محققان قرار گرفته اند. به عنوان آنزیم اصلی مرتبط با سخت شدن کوتیکول در حشرات شناخته شده است. دو شکل اصلی یافت شده است: لاکاز -1 و لاکاز -2. در این مقاله به بررسی وقوع ، نحوه عملکرد ، خصوصیات عمومی ، تولید ، کاربردها و بیحرکتی لاکها در زمینه های مختلف صنعتی می پردازیم.
اسلاید 5 :
مقدمه
در سالهای اخیر ، آنزیم ها در صنایع از اهمیت بالایی برخوردار شده اند. لاکازها یکی از این موارد هستند که به طور گسترده در طبیعت وجود دارد. لاک ها قدیمی ترین و مورد مطالعه ترین سیستم های آنزیمی هستند . این آنزیم ها حاوی 30 تا 30٪ کربوهیدرات و دارای جرم مولکولی 60-90 کیلو دالتون هستند. این مس حاوی 1،4-بنزنزول است: اکسیدوردوکتازهای اکسیژن (EC 1.10.3.2) که در گیاهان بالاتر و میکروارگانیسم ها یافت می شوند. اینها گلیکوزیله پلی فنول اکسیدازها هستند که حاوی 4 یون مس در هر مولکول هستند که 1 الکترون اکسیداسیون فنلیک و ترکیب مربوط به آن را انجام می دهند و اکسیژن را به آب کاهش می دهند . هنگامی که بستر توسط لاکاز اکسیده می شود ، یک الکترون منفرد از دست می دهد و معمولاً یک رادیکال آزاد را تشکیل می دهد که ممکن است تحت اکسیداسیون بیشتر یا واکنشهای غیرآنزیمی شامل هیدراتاسیون ، عدم تناسب و پلیمریزاسیون قرار بگیرد.
اسلاید 6 :
این آنزیم ها از جنس پلیمر هستند و به طور کلی حاوی 1 عدد از مرکز 1 ، نوع 2 و مرکز مس زیر واحد نوع 3 هستند که در آن نوع 2 و نوع 3 در کنار هم قرار دارند و یک خوشه مس سه هسته ای تشکیل می دهند.
لاکازها به طور گسترده در گیاهان بالاتر ، باکتریها ، قارچها و حشرات توزیع می شوند. در گیاهان ، لاکچری ها در کلم ، شلغم ، سیب زمینی ، گلابی ، سیب و سایر سبزیجات یافت می شوند. آنها از قارچ Ascomyceteous ، Deuteromycteous و Basidiomycetous جدا شده اند كه بيش از 60 سويه قارچي به آنها تعلق دارد . قارچ Basidiomycetes پوسیدگی سفید ، لیگنین را در مقایسه با آسکومایس و دوترومایزها که ترکیبات فنلی را اکسیده می کنند ، به رادیکال های فنوکسی و کینین تبدیل می کند .
اسلاید 7 :
لاکها نقش مهمی در صنایع غذایی ، صنایع کاغذ و خمیر ، صنعت نساجی ، شیمی مصنوعی ، مواد آرایشی ، تجمع خاک و زیست تخریب آلودگی فنلی محیطی و از بین بردن اخلالگرهای غدد درون ریز بازی می کنند. این آنزیم ها برای ترشح پالپ ، تخریب سموم دفع آفات یا حشره کش ها ، سنتز آلی ، سم زدایی زباله ، تغییر رنگ نساجی ، مصارف فن آوری مواد غذایی و کاربردهای بیوسنسوری و تحلیلی استفاده می شوند.
اخیراً لاکازها به دلیل توانایی آنها در کاتالیز کردن واکنش های انتقال الکترون بدون کوفاکتور اضافی ، به طور مؤثر در نانوبیوتکنولوژی مورد استفاده قرار گرفته اند. تکنیک بی حرکت مولکولهای زیستی مانند لایه به لایه ، میکروپراستینگ و تکنیک تک لایه خود مونتاژ می تواند برای حفظ فعالیت آنزیمی لاکازها مورد استفاده قرار گیرد.
اسلاید 8 :
منابع Laccases
لاكاز به طور كلي در گياهان و قارچ هاي بالاتر مشاهده مي شود ، اما اخيراً در برخي از باكتري ها از جمله S.lavendulae ، S.cyaneus و Marinomonas mediterranea يافت شده است. در قارچها ، لاکازها بیشتر از گیاهان بالاتر ظاهر می شوند. Basidiomycetes مانند Phanerochaete chrysosporium ، Theiophora terrestris و Lenzites ، بتولینا و قارچ های پوسیدگی سفید مانند Phlebia radiate ، Pleurotus ostreatus و Trametes versicolour نیز لاکاز تولید می کنند. بسیاری از گونه های تریکودرما مانند T. atroviride ، T. harzianum و T. longibrachiatum منبع لاک ها هستند. لاکاز از شاخص مونوسیلیوم اولین لاکاز بود که از آسکوسیت ها مشخص شد و فعالیت پراکسیداز را نشان می دهد. Pycnoporus cinnabarinus لاکاز را به عنوان آنزیم لیگنینولیتیک تولید می کند ، در حالی که Pycnoporus sanguineus لاکاز را به عنوان فنل اکسیداز تولید میکند.
اسلاید 9 :
در گیاهان ، لاکاز نقش مهمی در lignification دارد ، در حالی که در قارچ ها از آن در ترشح ، اسپور سازی ، تولید رنگدانه ، تشکیل بدن حاصلخیز و پاتوژنز گیاه استفاده شده است. پارامترهای ورسکولور نیز لاکاز تولید می کنند. بسیاری از گونه های تریکودرما مانند T. atroviride ، T. harzianum و T. longibrachiatum منبع لاک ها هستند. لاکاز از شاخص مونوسیلیوم اولین لاکاز بود که از آسکوسیت ها مشخص شد و فعالیت پراکسیداز را نشان می دهد. Pycnoporus cinnabarinus لاکاز را به عنوان آنزیم لیگنینولیتیک تولید می کند ، در حالی که Pycnoporus sanguineus لاکاز را به عنوان فنل اکسیداز تولید می کند. در گياهان ، لاكاز در ترشحات نقش دارد ، در حالي كه در قارچها در ترك خوردگي ، اسپوريلاسيون ، توليد رنگدانه ، تشكيل بدن باروري و پاتوژنز گياهان نقش دارد.
اسلاید 10 :
مکانیسم لاک ها
کاتالیز لاکاز به دلیل کاهش یک مولکول اکسیژن به آب همراه با اکسیداسیون یک الکترون با طیف گسترده ای از ترکیبات معطر است که شامل پلی فنول ، مونوفنول های جایگزین شده با متیوکسی و آمین های معطر است . لاکازها حاوی 4 اتم مس هستند که به اصطلاح Cu T1 (جایی که بستر کاهش می یابد) و خوشه مس سه هسته ای T2 / T3 (انتقال الکترون از نوع I مس به نوع II مس و نوع III مس مس خوشه trinuclear / کاهش اکسیژن به آب در خوشه trinuclear ) این چهار یون مس در سه دسته طبقه بندی می شوند: نوع 1 (T1) ، نوع 2 (T2) و نوع 3 (T3). این سه نوع را می توان با استفاده از طیف سنجی پارامغناطیس UV / قابل مشاهده و الکترونیکی (EPR) تشخیص داد.
اسلاید 11 :
در حالت اکسیداسیون ، نوع 1 مس رنگ آبی را به پروتئین با جذب 610 نانومتر می دهد که قابل تشخیص EPR است ، نوع 2 مس رنگی نمی دهد بلکه EPR قابل تشخیص است و نوع 3 مس حاوی یک جفت اتم در یک ترکیب دو هسته ای است. که جذب ضعیفی در ناحیه UV نزدیک دارند اما با سیگنال EPR قابل تشخیص نیستند . مس نوع 2 و مس نوع 3 یک مرکز trinuclear است که در مکانیسم کاتالیزوری آنزیم نقش دارد. مولکول O2 برای فعال سازی نامتقارن به خوشه trinuclear متصل می شود ، و فرض بر این است که محفظه اتصال O2 به نظر می رسد دسترسی عوامل اکسید کننده را محدود می کند. در طی حالت پایدار ، کاتالیز لاکاز نشان می دهد که کاهش O2 صورت می گیرد . لاکاز به عنوان باتری عمل می کند و الکترون ها را از واکنش های اکسیداسیون فردی برای کاهش اکسیژن مولکولی ذخیره می کند.
اسلاید 12 :
از این رو ، اکسیداسیون چهار مولکول کاهش دهنده بستر برای کاهش کامل اکسیژن مولکولی به آب ضروری است. وقتی لاکاز بستر را اکسید می کند ، رادیکال های آزاد تولید می شوند. تخریب لیگنین انجام شده توسط رادیکال فنوکسی منجر به اکسیداسیون در α-کربن یا شکاف پیوند بین α-کربن و β- کربن می شود. این اکسیداسیون منجر به رادیکال آزاد محور اکسیژن می شود ، که می تواند به یک واکنش دوم آنزیم کاتالیز شده به کینون تبدیل شود. سپس quinone و رادیکال های آزاد می توانند تحت پلیمریزاسیون قرار گیرند . ساماندهی مکانهای مس در لاکاز توسط مطالعات طیف سنجی توضیح داده شده است که نشان می دهد مس نوع 2 دو اتم اکسیژن او و یک اکسیژن را به عنوان OH هماهنگ می کند در حالی که هر یک از مس های نوع 3 سه باقیمانده خود را هماهنگ می کند. علاوه بر این ، هر دو سایت مس و T2 و T3 دارای موقعیت هماهنگی باز نسبت به مرکز خوشه های trinuclear با محفظه پروتئین منفی هستند .
اسلاید 13 :
کاتالیز واسطه لاکاز را می توان با درج واسطه ها به بسترهای غیر فنلی گسترش داد. واسطه ها ترکیبات آلی با وزن کم مولکولی هستند که توسط لاکاز اکسیده می شوند. رادیکال های کاتیون بسیار فعال ترکیبات غیر فنلی را که لاکاز به تنهایی قادر به اکسیداسیون نیست ، اکسیده می کنند. متداول ترین واسطه های مصنوعی عبارتند از:
1-هیدروکسی بنزوتریازول (HOBT) ، N-هیدروکسی فتالیمید (NHPI) ، 2،2'-azinobis- (3-اتیل بنزاتیازولین-6-سولفونات) (ABTS) ، و 3 اسید هیدروکسی آنترانیلیک . در حضور جذب اکسیژن ABTS توسط لاکاز سریعتر از HOBT است.
خواص آنزیم لاکاز
لاكازها عمدتاً گلیكوپروتئینهای مونومر ، دیمر و تترامری هستند. گلیکوزیلاسیون نقش مهمی در حفظ مس ، ثبات حرارتی ، حساسیت به تخریب پروتئولیتیک و ترشح دارد. پس از خالص سازی ، آنزیم های لاکاز ناهمگونی قابل توجهی را نشان می دهند. محتوای گلیکوزیلاسیون و ترکیب گلیکوپروتئین با ترکیب محیط رشد متفاوت است.
اسلاید 14 :
تصفیه لاکاز
سولفات آمونیوم سالهاست که برای تصفیه آنزیم مورد استفاده قرار می گیرد. اما محققان روشهای بسیار کارآمدتری مانند بارش پروتئین توسط سولفات آمونیوم ، کروماتوگرافی تبادل آنیون ، تبادل نمک / بافر پروتئین و کروماتوگرافی فیلتراسیون ژل را یافته اند. تصفیه تک مرحله ای لاکاز از عصاره Neurospora با استفاده از کروماتوگرافی سلیت انجام می شود و 54 برابر خالص سازی با فعالیت خاص 333 U mg mg-1 به دست می آید . لاكاز از LLP13 ابتدا با كروماتوگرافي ستون خالص و سپس با فيلتراسيون ژل تصفيه شد [10 ، 11]. لاکتاز T. Versicolour با استفاده از رسوب اتانول ، DEAE-Sepharose ، فنیل-سفاروز و Sephadex G-100 کروماتوگرافی که یک لاکاز تک مونومر با فعالیت خاص 91443 U U mg-1 می باشد ، تصفیه می شود. لاکاز از T. Versicolour با کروماتوگرافی یون تبادل و به دنبال آن فیلتراسیون ژل با فعالیت خاص 101 U میلی لیتر − 1 و 34.8 برابر تصفیه خالص می شود . لاکاز از Stereum ostrea با سولفات آمونیوم خالص می شود و به دنبال آن کروماتوگرافی ستونی Sephadex G-100 با خالص سازی 70 برابر . لاكاز از بدن ميوه سازي با رسوب سولفات آمونيوم با 40 تا 70٪ اشباع و كروماتوگرافي سلولز DEAE خالص مي شود و سپس به ترتيب 1.34 و 3.07 برابر به دست مي آيند.
اسلاید 15 :
کاربرد laccase
لاکاز مهم است زیرا هم بسترهای سمی و غیر سمی را اکسیده می کند. این ماده در صنایع نساجی ، صنایع فرآوری مواد غذایی ، صنایع فرآوری چوب ، صنایع داروسازی و صنایع شیمیایی مورد استفاده قرار می گیرد. این آنزیم بسیار خاص ، زیست محیطی پایدار و یک کاتالیزور ماهر است. کاربردهای لاکاز به شرح زیر است.
رنگ آمیزی رنگ
صنعت نساجی از حجم زیادی آب و مواد شیمیایی برای فرآوری مرطوب استفاده می کند. این مواد شیمیایی از ترکیبات معدنی گرفته تا ترکیبات آلی متغیر هستند. ساختار شیمیایی رنگها هنگام قرار گرفتن در معرض نور ، آب و سایر مواد شیمیایی مقاومت در برابر محو شدن را نشان می دهد. لاکاز رنگ را کاهش می دهد. به همین دلیل فرآیندهای مبتنی بر لاکاز توسعه یافته اند که شامل رنگهای مصنوعی بوده و امروزه در صنعت مورد استفاده قرار می گیرند.
اسلاید 16 :
بلونکز و همکاران. از T. Versicolour به شکل گلوله برای درمان ترشحات مشروبات سیاه برای سم زدایی و کاهش رنگ ، ترکیبات معطر و میزان اکسیژن شیمیایی (COD) استفاده کرد. آنها دریافتند که ترکیبات رنگی و معطر تا 70-80٪ کاهش می یابد و COD تا 60٪ کاهش می یابد. آنها نتیجه گرفتند که T. versicolour قادر به تولید لاکاز است. T. versicolour به طور کامل Amaranth ، Tropaeolin O ، Reactive Blue 15 ، Kongo Red و Reactive Black 5 را بدون جذب رنگ تجزیه می کند ، در حالی که تا حدی رنگ Brilliant Red 3G-P ، Brilliant Yellow 3B-A و Remazol Brilliant Blue R را با مقداری جذب رنگ . آنها دریافتند که پس از رنگ زدایی ، سمیت تعداد کمی از رنگها در حالی باقی می ماند که برخی از آنها غیر سمی بود .
رنگهای موی مبتنی بر لاکاز نسبت به رنگهای معمولی مو تحریک کننده و راحت تر عمل می کنند زیرا لاک ها جایگزین H2O2 در فرمولاسیون رنگ می شوند. از لاکازها نیز در فرآیند کلرلاسیون استفاده می شود. زایلیدین یک القا کننده لاکاز است که باعث افزایش فعالیت آنزیم کلرزاسیون می شود و به همین دلیل غلظت اکسیژن محلول کاهش می یابد . رومرو و همکاران دریافت که باکتری های S. مالتوفیلیا برخی رنگهای مصنوعی (متیلن آبی ، متیل سبز ، تولویدین آبی ، قرمز کنگو ، متیل نارنجی و صورتی) و همچنین پساب صنعتی را تجزیه می کنند.
اسلاید 17 :
تجزیه بیولوژیکی
به دلیل صنعتی شدن سریع و استفاده گسترده از سموم دفع آفات برای بهرهوری بهتر کشاورزی ، آلودگی خاک ، آب و هوا صورت می گیرد که امروزه یک مشکل جدی زیست محیطی است. بی فنیل های پلی کلر (PCB) ، بنزن ، تولوئن ، اتیل بنزن ، زایلن (BTEX) ، هیدروکربن های آروماتیک چند حلقه ای (PAH) ، پنتاکلرو فنل (PCP) ، 1،1،1-trichloro-2،2-bis (4-chlorophenyl) اتان ( DDT) و trinitrotoluene (TNT) موادی هستند که به دلیل سرطان زایی و همچنین اثر جهش زا شناخته شده و در محیط پایدار هستند. قارچها طیف گسترده ای از مواد شیمیایی خطرناک را نوسازی می کنند. به همین دلیل است که علاقه محقق در آنها ایجاد می شود .
T. versicolour برای تجمع زیست محیطی آترازین در خاک با رطوبت کم و محتویات آلی که بطور معمول در اکوسیستم های نیمه خشک و مدیترانه ای وجود دارد ، استفاده می شود .
اسلاید 18 :
كوم و لی لاكاز را از T. Versicolour و Pleurotus ostreatus برای تخریب PCB و همچنین فنل بدست آوردند و با افزایش كلیناسیون ، میزان تخریب كاهش می یابد و نتیجه می گیرند كه 3-هیدروكسی بیفنیل در برابر لاكاز مقاوم تر از 2- یا آنالوگهای 4-هیدروکسی. پس از پنج روز از جوجه کشی ، هنگامی که گلوکز و فروکتوز به عنوان کیهانوبراست مورد استفاده قرار گرفتند ، بیش از 71٪ از اسیدهای پتاسید هیدروکسی بنزوئیک و 56٪ اسید پروتوکاتوئیک اسید تخریب شدند .
لاکاز به دست آمده از T. villosa با تخریب 2،4-DCP (2،4-دی کلرووفنول) خاک را اصلاح می کند. آزمایشی توسط احم انجام شد که در آن دو نوع خاک به خود گرفت: در خاک 1 ، لاکهای آزاد و بی حرکت 100٪ از 2،4-DCP (بدون توجه به رطوبت) را حذف می کنند. در خاک 2 ، لاکاز بی حرکت بیشتر 2،4-DCP (حدود 95٪) از آنزیم آزاد (55٪ ، 75٪ و 90٪ ، با 30٪ ، 55٪ ، 100٪ حداکثر ظرفیت نگهداری آب) حذف کرد . Cerrena unicolosr لاکاز را در محیط نیتروژن کم تولید می کند که توانایی کاهش محتوای لیگنین از باگاس نیشکر را تا 36٪ در 24 ساعت در دمای 30 درجه سانتیگراد می دهد.
اسلاید 19 :
صنعت کاغذ و خمیر کاغذ
کلر و اکسیدانهای شیمیایی مبتنی بر اکسیژن برای جداسازی و تخریب لیگنین مورد استفاده قرار می گیرند که برای تهیه کاغذ در سطح صنعتی لازم است. اما برخی از مشکلات مانند بازیافت ، هزینه و سمیت حل نشده است. با این حال ، در فرایند سفید کننده موجود ، LMS می تواند به راحتی اجرا شود زیرا منجر به تعویض جزئی ClO2 در کارخانه های تولید پالپ می شود .
اسلاید 20 :
صنعت فرآوری مواد غذایی
در صنایع غذایی از لاکاز برای از بین بردن ترکیبات فنلی نامطلوب در پخت ، فرآوری آب ، تثبیت شراب و تجمع بیولوژیکی فاضلاب استفاده می شود . لاکاز نه تنها عملکرد بلکه خصوصیات حسی را نیز بهبود می بخشد. در صنعت آبجو ، لاکاز نه تنها ثبات را فراهم می کند بلکه ماندگاری آبجو را افزایش می دهد. در آبجو ، تشکیل مه ایجاد می شود که توسط پلی فنول پروانتوسیانیدین به طور طبیعی موجود تحریک می شود و از آن به عنوان سرماخوردگی یاد می شود.
در دمای اتاق یا بالاتر ، گرم شدن آبجو می تواند مجتمع را مجدداً حل کند. پس از مدت زمان مشخصی ، حلقه های فنولیک توسط گروه سولفیدریل جایگزین می شوند و مه دائمی تشکیل می شود که قابل حل نیست. برای اکسیداسیون پلی فنل ، از لاکاز استفاده شده است که قادر است اکسیژن اضافی را از بین ببرد و همچنین به همین دلیل ماندگاری آبجو افزایش می یابد . برای پایدار ساختن میوه میوه معمولاً از لاکاز استفاده می شود. ترکیبات فنل و فرآورده های اکسید کننده آنها به طور طبیعی در آب میوه وجود رنگ و طعم آن را به آب می بخشد. وقتی پلیمریزاسیون و اکسیداسیون فنلیک و پلی فنول اتفاق می افتد ، رنگ و عطر تغییر می کند.
