بخشی از پاورپوینت
اسلاید 1 :
محاسبه مرتبط با پرایمر
اسلاید 2 :
واژه شناسی
تفاوت مقدار با غلظت
غلظت های رایج و استاندارد
مول، مولار، مولاریته
جذب نوری
بافر و مشخصات بافری
لیوفلایز
اسلاید 3 :
چگونه ویال پرایمر را آماده کنیم؟
الیگونوکلئوتید را در بافر تریس حل کنید.
TE [10 mM Tris-HCl (pH 8.0), 1 mM EDTA].
استفاده از بافر تریس نسبت به آب مقطر ارجح است، چرا که آب مقطر ممکن است اسیدی بوده و تا حدودی الیگونوکلئوتید را هیدرولیز نماید.
اسلاید 4 :
چه مدت می توان پرایمر را نگهداری نمود؟
در صورت لیوفلایز بودن در منفی 20 درجه به مدت یکسال
بصورت محلول در بافر تریس در یخچال معمولی و یا منفی 20 درجه به مدت 6 ماه
در صورت محلول در آب در غیاب نوکلئازها، به مدت 6 ماه در منفی 20 درجه
در صورت خنثی نبودن اسیدیته آب، امکان پورین زدایی وجود دارد.
پرایمر حل شده در آب مقطر را در دمای 4 درجه نگهداری نمی کنند.
اسلاید 5 :
معیار سفارش میزان پرایمر چیست؟
بر مبنای تعداد واکنش مورد نیاز سفارش دهید.
در صورتی که حجم واکنش 100 میکرولیتر باشد و غلظت نهایی پرایمر در محدوده 0/1 تا 0/5 میکرومولار باشد، از جدول ذیل می توان بهره گرفت. (50 نانومولار)
اسلاید 6 :
تعیین کمیت پرایمر به روش اسپکتروفوتومتری
پرایمر الیکوت شده را با آب مقطر به حجم نهایی 1 میلی لیتر برسانید برای 15 ثانیه ورتکس (پیپت) نمایید و جذب نوری در 260 نانومتر را بخوانید. از محاسبه ذیل استفاده نمایید.
قانون بیر لامبرت: A=e.c.l
Concentration in µg/ml = A260 × Weight per OD × dilution factor
Concentration (µg/ml) = (A260 reading – A320 reading) × dilution factor × 50µg/ml
مثلا چنانچه 50 میکرولیتر نمونه پرایمر را با 950 میکرولیتر
آب رقیق نموده اید فاکتور رقت 20 خواهد بود.
The concentration of pure double-stranded DNA with an A260 of 1.0 is ? µg/ml
اسلاید 7 :
غلظت پرایمر را چگونه محاسبه کنیم؟
معمولا پرایمر بر اساس وزن تحویل داده می شود که با انحلال آن، غلظت را خود تعیین و محاسبه می کنیم. مثال:
اگر پرایمر 25 نانومول باشد.
در یک میلی لیتر از بافر حل کنیم مقدار فوق به غلظت 25 نانومول در میلی لیتر یا همان 25000 نامول در لیتر یا 25 میکرو مول در لیتر یا 25 میکرو مولار تبدیل می شود.
چنانچه اعداد از سه رقم تجاوز نماید می بایست تغییر واحد داده شود.
اسلاید 8 :
محاسبه غلظت رایج از جذب نوری
اگر جذب نوری پرایمر بعد از رقیق سازی 10 میکرولیتر از آن معادل 0/14 بوده باشد:
کمپانی سازنده بار جذب نوری را 36/6 اعلام کرده باشد.
غلظت پرایمر محاسبه خواهد شد:
0/14×36/6×100 = 512/4 میکروگرم در میلی لیتر
اسلاید 9 :
محاسبه غلظت رایج از جرم مولکولی
جرم مولکولی یک پرایمر 7440 می باشد.
غلظت پرایمر 70 میکرو مولار اعلام شده است.
7440 جرم مولکولی به معنای گرم در مول و یا میکروگرم در میکرومول می باشد
7440 میکروگرم در میکرومول × 70 میکرومول در لیتر = 520800 میکروگرم در لیتر
معادل 520/8 میکرو گرم در میلی لیتر
اسلاید 10 :
تعیین جرم مولکولی پرایمر
اسلاید 11 :
رسوب دهی با اتانل
در صورت نیاز فقط پرایمرهایی با طول بیش از 20 باز و جذب نوری 0/1 را می توان با اتانل رسوبدهی نمود.
پرایمر خشک در داخل میکروتیوب را در بافر استات سدیم حل نمایید. 0.2 ml of 0.3 M Sodium Acetate (pH 7.0).
میزان 0/6 میلی لیتر اتانل مطلق سرد (منفی 20) به آن افزوده و نیم ساعت در دمای یخچال انکوبه کنید.
نیم ساعت با دور 10،000 سانتری فیوژ کنید.
با دقت محلول سوپرناتانت را خارج کنید.
یک میلی لیتر اتانل سرد 70% بیافزایید.
ده دقیقه با دور 10،000 سانتریفیوژ کنید.
با دقت محلول فوقانی را خارج نموده و رسوب را خشک نمایید.
در دمای منفی 20 نگهداری نمایید.
