بخشی از پاورپوینت
اسلاید 1 :
به نام خدا
Agroinoculation
اسلاید 2 :
مقدمه
انتقال ژن فرآیندی است که طی آن، قطعه مشخصی از DNA به درون سلولها وارد میشود.
به انتقال هدایت شده ژن از یک موجود زنده به موجود زنده دیگر و تلفیق و بیان پایدار آن ژن در ژنوم موجود پذیرنده، انتقال ژنتیکی ( تراژنی) گفته می شود.
ژن منتقل شده تراژن(Transgene) نامیده می شود.
سیستم اگروباکتریوم اولین سیستم تراریختی موفق در گیاهان می باشد (1983)
غلبه بر دستکاری ژن های گیاهی با شناخت خصوصیات و بهره برداری از پلازمیدهای Ti و Ri محقق گردید
این پلازمید ها امکان انتقال طبیعی ژن، بیان ژن و سیستم های گزینش را فراهم می کنند.
اسلاید 3 :
Agrobacterium
باکتری گرم منفی، میله ای شکل
متعلق به خانواده Rhizobiaceae
اغلب در نزدیکی سطح خاک (در ناحیه طوقه)
اسلاید 4 :
Agrobacterium
A. tumefaciens عامل بیماری گال طوقه و دارای پلازمید Ti
A. Rhizogenes عامل بیماری ریشه موئی و دارای پلازمید Ri
A. Radiobacter گونه غیر بیماریزا و بدون پلازمید
براساس خوصیات بیماریزایی و داشتن پلازمید Ti و Ri طبقه بندی قدیمی این جنس شامل
امروزه A. tumefacience به عنوان موثرترین مهندس ژنتیک گیاهی
در طبیعت مطرح شده است
اسلاید 5 :
سازماندهی پلازمید Ti
مولکول های حلقوی بزرگ (800-200 کیلو باز)
به صورت واحد های ژنتیکی خود تکثیر در سلول های باکتریایی
دارای مناطق بزرگی برای بیماری زایی، شروع همانند سازی، سرطان زایی و کاتابولیسم اپین ها هستند
اسلاید 6 :
سازماندهی پلازمید Ti
اسلاید 7 :
سازماندهی پلازمید Ti
ژن های سرطان زا جهت تومورزایی و ساخته شدن اپین ها ضروری اند
قسمتی از پلازمید Ti که به گیاه منتقل می شود T-DNA نام دارد.
در منطقه T-DNA هیچ ژنی که برای انتقال آن به گیاه ضروری باشد، وجود ندارد.
این منطقه ژن های سرطان زا را در بر می گیرد.
پلازمید Ti خلع سلاح شده
اسلاید 8 :
انتقال T-DNA
جهت انتقال T-DNA به سلول گیاه سه عامل مورد نیاز می باشد.
مرز راست و چپ T-DNA
ژن های ناحیه vir
ژن های کروموزومی مانند chvA، chvB و pscA
اسلاید 9 :
ناقل های مبتنی بر آگروباکتریوم
ساده ترین روش برای بهره گرفتن از پلازمید Ti جهت انتقال ژن به گیاهان، وارد کردن توالی ژن مورد نظر به داخل ناحیه T-DNA و سپس استفاده از پلازمید Ti و باکتری A. tumefacience می باشد تا این توالی ژنی را وارد سلول گیاه کرده و به داخل ژنوم گیاه الحاق کند.
اسلاید 10 :
دلایل عدم استفاده مستقیم از پلازمید Ti
تولید هورمون های گیاهی توسط سلول های ترنسفورم شده در محیط کشت، که از باززایی آنها به گیاهان بالغ جلوگیری می کند.
تولید اپین با استفاده از منابع گیاهی در صورت حذف نشدن ژن تولید اپین
اندازه بزرگ پلازمید Ti
فقدان مکان های برشی منحصر به فرد برای آنزیم های برشی
عدم تکثیر پلازمید Ti در باکتری های دیگر مانند E. coli
اسلاید 11 :
مراحل اصلاح پلازمید Ti
افزودن یک ژن مارکر گزینشگر جهت اعطای مقاومت به سلول های گیاهی ترنسفورم شده
افزودن یک ناحیه شروع همانند سازی (ori) به پلازمید جهت همانندسازی در E.coli
حفظ توالی مرزی راست T-DNA(جهت الحاق و پیوستن T-DNA به توالی DNA سلول گیاهی لازم است)
افزودن یک پلی لینکر (MCS) جهت تسهیل الحاق ژن کلون شده به ناحیه بین توالی های مرزی T-DNA
اسلاید 12 :
انواع ناقل
Binary
vectors
Co-integrate
vectors
با توجه به اینکه این ناقل های کلونینگ فاقد ژن های ناحیه Vir هستند، آنها قادر به انتقال و الحاق ناحیه T-DNA (ژن مورد نظر) به داخل سلول و کروموزوم سلول گیاه میزبان نمی باشند. بنابراین دو پلازمید Ti از سیستم ناقل مشتق شده توسعه پیدا کرده است.
اسلاید 13 :
Co-integrate vectors
به ناقلینی که از طریق همولوژی DNA، به درون یک پلازمید ساکن Ti باز ترکیب می شوند، ناقلین تلفیقی یا ناقلین مشترک می گویند.
اسلاید 14 :
اجزای ناقل تلفیقی (Co-integrate vectors)
مکان های مناسب برای جا دادن ژن مورد نظر (MCS)
ژن یا ژن های نشانگر گزینشگر آنتی بیوتیکی فعال در E. coli و A. tumefaciens
یک ژن نشانگر گزینشگر فعال در گیاه
نقطه شروع همانندسازی فعال در E.coli که در آگروباکتریوم عمل نمی کند.
اسلاید 15 :
Binary vectors
اسلاید 16 :
اجزای ناقل دوتایی (Binary vectors)
مکان کلونینگ چند گانه (MCS)
یک نقطه شروع همانند سازی با قابلیت عمل در طیف وسیعی از میزبان ها (مثل E. coli و A. tumefaciens)
نشانگرهای گزینشکر برای باکتری ها و گیاهان
توالی های مرزی T-DNA (هرچند فقط توالی مرزی سمت راست مطلقا ضروری است)
اسلاید 17 :
مزایای استفاده از ناقلین دوتایی
به پروسه های نوترکیبی در in vivo نیاز ندارند در حالیکه ناقلین تلفیقی برای ماندگاری دائم در درون نژاد آگروباکتریوم هدف، حتما به یک فرآیند نوترکیبی نیاز دارند.
به جای پلازمید بزرگ نوترکیب، از ناقل های کوچک استفاده می شود که سبب افزایش سرعت و راندمان انتقال می شود.
اسلاید 18 :
مهمترین لازمه ها برای انتقال ژن توسط آگروباکتریوم
تولید استوسیرینگون یا دیگر ترکیبات مرتبط با آن توسط ریز نمونه گیاهی یا تحریک باکتری توسط استوسیرینگون مصنوعی جهت فعال شدن ژنهای ناحیه vir
باززایی گیاهان کامل توسط سلول ها و بافت های مستعد برای ترانسفورماسیون
اسلاید 19 :
روش های تلقیح
آلوده سازی گیاهان زخمی
کشت توام
روش دیسکی برگی
روش دیسکی از نظر تکنیکی ساده بوده و خیلی سریع گیاهان تراریخته تولید می کند. از این رو در حال حاضر استفاده از این روش ترجیح داده می شود.
