بخشی از پاورپوینت
اسلاید 1 :
عنوان: مروری بر روش کرماتوگرافی مایع با کارایی بالا (HPLC)
اسلاید 3 :
تاریخچه کروماتوگرافی
مهمترین و پرکاربردترین روش جداسازی، روش "کروماتوگرافی" است.
كروماتوگرافی (Chromatography)، بوسيله گياهشناسی روس به نام تسوت، در اوايل قرن بيستم (1903) كشف شد.
او از اين تكنيك برای جداسازی رنگدانههای مختلف گياهی مانند كلروفيلها و گزانتوفيلها استفاده کرد.
اسلاید 4 :
تاریخچه کروماتوگرافی
روشهای کروماتوگرافی بر پایه دو مفهوم کلی دسته بندی میشوند:
در روش اول، جداسازی بر اساس مفاهیم فیزیکی صورت میگیرد.
این روش شامل دو گروه کروماتوگرافی ستونی (Column) و کروماتوگرافی سطحی است.
اسلاید 5 :
تاریخچه کروماتوگرافی
اساس نامگذاری در دسته بندی دوم که مرسومتر است.
نوع فاز متحرک، فاز ساکن و نوع تعادل ایجاد شده بین دو فاز است.
این دسته شامل دو گروه کلی میشود:
کروماتوگرافی مایع (فاز متحرک مایع میباشد)
کروماتوگرافی گازی (فاز متحرک گاز)
اسلاید 6 :
مفاهیم کلیدی در کروماتوگرافی
درتمامی روشهای کروماتوگرافی، جداسازی بر پایه.
تفاوت مقداری آنالیت (ماده مورد جداسازی) در دو فاز ساکن (Stationary Phase) و متحرک (Mobile Phase) انجام میشود.
این تفاوت مقدار، منجر به تشکیل تعادلی میگردد که آن را با پارامتری به نام ثابت توزیع (K) بیان میکنند.
Cm نشان دهنده غلظت مولی آنالیت در فازمتحرک است.
Cs نشان دهنده غلظت مولی آنالیت در فاز ساکن است.
اسلاید 7 :
مفاهیم کلیدی در کروماتوگرافی
پدیدههای فیزیکی و شیمیایی متفاوتی بر سرعت جداسازی و پهنای باند دیده شده برای هر آنالیت تأثیر دارند.
از بین تئوریهای موجود که به توجیه و محاسبه این عوامل میپردازند، تئوری بشقابکهای فرضی (Plates) کاربرد بیشتری دارد.
اسلاید 8 :
مفاهیم کلیدی در کروماتوگرافی
در تئوری بشقابکهای فرضی، هرستون از یک سری لایههای باریک، افقی وکاملاً مجزا که به طور متوالی قرار گرفتهاند، تشکیل شده است.
به هر یک از این لایهها، بشقابک گفته میشود.
در هر بشقابک آنالیت در تعادلی بین فاز متحرک و ساکن قرار دارد.
با انتقال بین بشقابکها عمل جداسازی صورت میپذیرد.
اسلاید 9 :
مفاهیم کلیدی در کروماتوگرافی
کارایی هر ستون به تعداد بشقابکهای موجود درستون و یا به عبارت دیگر به تعداد تعادلهای ایجاد شده در ستون بستگی دارد.
برای بررسی کارایی ستون تعداد بشقابکهای فرضی (N) را از رابطه زیر محاسبه میکنند.
H: ارتفاع هر بشقابک
L: طول ستون
اسلاید 10 :
کروماتوگرافی مایع با کارایی بالا
از میان تکنیکهای جداسازی.
کروماتوگرافی مایع با کارایی بالا (High Performance Liquid Chromatography -HPLC)، بیشترین رشد و کارایی را داشته است.
اسلاید 11 :
کروماتوگرافی مایع با کارایی بالا
سالیانه میلیونها دلار صرف خرید و فروش دستگاههایHPLC در دنیا میشود.
علت این رشد:
حساسیت بالا
تعیین مقدار کمی با صحت بالا
قابلیت آنالیز نمونههای غیرفرار و حساس به دما
این موارد با تکنیکGC (کروماتوگرافی گازی) امکانپذیر نیستند.
اسلاید 12 :
قاعدهای کلی در مورد قطبیت فازهای ساکن و متحرک:
قطبیت حل شونده و فاز متحرک باید نزدیک به هم باشد، ولی با فاز ساکن اختلاف داشته باشد.
ترتیب قطبیت گروههای عاملی در ترکیبات به صورت زیر است:
هیدروکربن < اترها < استرها < کتونها < آلدئیدها < آمیدها < آمینها < الکلها
اسلاید 13 :
فاز ساکن و فاز متحرک
خصوصیات فاز متحرک در HPLC :
درصد خلوص بالا
نقطه جوش بالاتر از دمای ستون
واکنش پذیری کم (Inertness)
قابلیت تطابق با آشکارساز
اسلاید 14 :
اجزاء و قسمتهای مختلف دستگاه HPLC
دستگاه و تجهیزات HPLC:
مخازن حلال:
كه در آنها فاز متحرک و يا حلالهای شستشو دهنده ستون ريخته شده است.
اسلاید 15 :
اجزاء و قسمتهای مختلف دستگاه HPLC
موتور يا پمپ:
به منظور انتقال حلال و نمونه در فضای نسبتاً طویل ستون نیاز به ایجاد فشاری در سیستم است.
برای ايجاد فشار حداقل از یک پمپ يا موتور استفاده میشود.
حلال (فاز متحرک) توسط پمپ با سرعت و جریان ثابتی بر فاز ساکن حركت داده میشود.
فشار سیستم به اندازه (سایز) ذرات موجود در ستون، گرانروی (Viscosity) و سرعت جریان فاز متحرک بستگی دارد.
اسلاید 16 :
بسته به نوع جداسازی، میزان سرعت جریان فاز متحرک تعیین میگردد.
در سرعت جریان کم فاز متحرک ، فاصله بین پیکها افزایش یافته و جداسازی بهتری خواهیم داشت.
در ستونهایی با قطر مرسوم (کمتر از mm5) سرعت جریان نباید بالاتر از ml/min5/2 باشد؛ چون
باعث صدمه زدن به ستون و کاهش عمر مفید آن میشود.
اسلاید 17 :
به عنوان فاز متحرک، مخلوطی از حلالها در ازای یک حلال خالص بهکار گرفته میشود.
اسلاید 18 :
اجزاء و قسمتهای مختلف دستگاه HPLC
نسبت اجزاء فاز متحرک در طی یک تزریق ممکن است ثابت باشد.
در این صورت به آن روش ایزوکراتیک (Isocratic) گفته میشود.
در حالتی دیگر که به آن روش گراديانت (Gradient)گفته میشود.
طی یک تزریق و با پیشرفت زمان، طبق برنامهای که از قبل برای سیستم تعریف شده است، درصد متفاوتی از دو یا چند حلال مخلوط شده و در سیستم توسط پمپ جریان مییابد.
اسلاید 19 :
اجزاء و قسمتهای مختلف دستگاه HPLC
تزریق کننده (Injector):
تزریق نمونه، بسته به نوع دستگاه، به دو شکل دستی و یا خودکار انجام میگیرد.
در روش خودکار، نمونه در ظروف مخصوصی ریخته شده و در محل تعبیه شده در دستگاه قرار میگیرد.
پس از اینکه اپراتور دستور تزریق را (از طریق نرم افزار) میدهد، نمونه توسط یک سرنگ به سیستم منتقل میشود.
اسلاید 20 :
در روش دستی تزریق، از سرنگهایی با ظرفيتهای مختلف برای تزریق نمونه استفاده میشود.
حجم نمونه تزريق شده (در هر دو روش)، به حجم حلقه نمونهبردار(Loop ) بستگی دارد.
مقدار حلقه معمولاً در حد 5 تا 500 ميكروليتر است.
نمونه ابتدا وارد این حلقه شده و پس ازآماده شدن سیستم به همراه فاز متحرک وارد ستون میشود.
