بخشی از مقاله
*** این فایل شامل تعدادی فرمول می باشد و در سایت قابل نمایش نیست ***
بهینه سازی تولید آنزیم پکتیناز با روش های آماری طراحی آزمایش سطح پاسخ و تاگوچی
چکیده:
پکتینازها گروهی از آنزیم های هیدرولیتیک هستند که مواد پکتیکی را تجزیه می کنند. این آنزیم از مهمترین آنزیم های کاربردی در صنعت می باشد که توسط انواع مختلفی از میکروارگانیسم ها و گیاهان سنتز می شود. بحث مربوط به این پژوهش بهینه سازی تولید آنزیم پکتیناز با روش های آماری طراحی آزمایش سطح پاسخ و تاگوچی می باشد. در این پژوهش ابتدا قارچ آسپرژیلوس نایجر که مهمترین منبع تولید این آنزیم می باشد از محیط جداسازی و سپس بهینه سازی تولید آنزیم پکتیناز با روش های آماری ذکر شده انجام شد. در هر دو روش فاکتورها با تمام سطوح در مجموعه آزمایش ها مورد بررسی قرار گرفت. نتایج نشان داد که از بین فاکتورهای دما، رطوبت، pH و زمان تخمیر، بیشترین اثر در تولید آنزیم در روش سطح پاسخ مربوط به رطوبت و دما بوده است و شرایط بهینه تولید در رطوبت %50، دمای 400C، زمان تخمیر 3 روز و 5 pH بوده است و میزان تولید آنزیم در شرایط بهینه10/29 U/gr بوده است. مقایسه روش سطح پاسخ با 28 تیمار و تاگوچی با 32 تیمار نیز نشان داد، داده های بدست آمده از روش تاگوچی با روش سطح پاسخ همخوانی دارد ونقطه بهینه ارائه شده توسط هر دو روشتقریباً یکسان است و میزان تولیدآنزیم در شرایط بهینه شده با روش تاگوچی مقدار 11/33 U/gr می باشد.
کلمات کلیدی: پکتیناز، بهینه سازی، روش سطح پاسخ، روش تاگوچی
-1 مقدمه:
پکتین پلی ساکارید طویل از واحدهای گالاکتورونیک اسید می باشد که در دیواره سلولی و لایه های داخلی در گیاهان یافت می شود. پکتین در این مناطق به عنوان یک چسب عمل می کند که سایر پلی ساکارید های دیواره سلولی همچون سلولز، همی سلولز و نیز پروتئین هایی همچون اکستنسین که یک گلیکوپروتئین غنی از هیدروکسی پرولین می باشد را به خود و نیز به یکدیگر متصل می کند. اسکلت اصلی ملکول پکتین پلیمر دی گالاکتورونیک اسید تحت عنوان هموگالاکتوروناز (با اتصالات آلفا 4و(1 می باشد. پکتینازها یا آنزیم های تجزیه کننده پکتین توسط مخمرها، قارچ ها و گیاهان سنتز می شوند. هدف از تجزیه پکتین در میکروارگانیسم ها کسب منبع کربن موجود در پکتین به عنوان ماده غذایی بوده، ولی هدف تجزیه پکتین در گیاهان تغییر ساختار پکتین در جهت رشد گیاه یا نرم شدن میوه می باشد. از مهمترین آنزیم های پکتیناز تولید شده توسط میکروارگانیسم ها و گیاهان می توان به پلی گالاکتورونازها، استرازها و لیازها اشاره کرد. مهمترین منبع تولید این آنزیم قارچ آسپرژیلوس نایجر می باشد.
این آنزیم در صنایع مختلفی همچون صنایع غذایی، صنایع آبجوسازی، صنایع آبمیوه سازی، صنعت نساجی، صنایع دارویی و بهداشتی کاربردهای بسیار گسترده ای دارد. آنزیم پکتیناز به سه روش تخمیر غوطه ور، تخمیر حالت جامد و کشت سطحی تولید می گردد .روش حالت جامد نسبت به روش های دیگر به دلیل استفاده از ضایعات کشاورزی- صنعتی (منابع کربن با ارزش اقتصادی پایین) محصول دهی بیشتر و تولید پساب کمتر ترجیح داده می شود. مطالعات بسیاری روی تولید پکتیناز از مواد مانند تفاله لیمو، سبوس گندم ،تفاله انگور باگاس نیشکر صورت گرفته است(کشیاپ و همکاران2002، آنتوف و همکاران2001 ، بوتلا وهمکاران .(2005 در پژوهش حاضر اثر پارامترهایی تخمیر و ترکیب محیط کشت بر تولید آنزیم پکتیناز با به کارگیری روش طراحی آزمایش سطح پاسخ و روش تاگوچی مورد بررسی قرار گرفته است که روش سطح پاسخ مجموعه ای از تکنیک های ریاضی و آماری برای مدل کردن و تحلیل مسائلی است که یک متغییر پاسخ توسط چندین متغییر تاثیر می پذیرد و هدف بهینه کردن متغیر پاسخ است و روش تاگوچی یکی از انواع طراحی آزمایش به صورت فاکتوریل جزئی است که تعداد آزمایش ها ی لازم برای بهینه سازی شرایط تولید به تعداد معدودی قابل کاهش است.
-2 مواد و روشها:
1-2 میکروارگانیسم:
آسپرژیلوس نایجر از سیب در حال فساد و نمونه هایی از خاک جداسازی گردیده و بر روی محیط کشت PDA اسلنت شده منتقل شد و در یخچال نگهداری گردید.
2-2 محیط کشت:
محیط کشت تخمیر برای تولید آنزیم حاوی منبع کربنی تفاله چغندرقند و محیط کشت پایه معدنی شامل دو بخش اجزای اصلی و اجزای کم مقدار به صورت زیرمی باشد(: (g/l
اجزای اصلی:
اجزای کم مقدار:
هر لیتر از محیط کشت معدنی مورد استفاده شامل975میلی لیتر از محلول عناصر اصلی و25 میلی لیتر از عناصر جزئی می باشد. تمام پارامترهای مورد بررسی بر اساس روش سطح پاسخ و تاگوچی تهیه گردید و تخمیر در ارلن های100 میلی لیتری انجام شد.
3-2 سنجش فعالیت آنزیم:
بعد از تخمیر، محیط تخمیر با آب جداسازی شده وفعالیت آنزیم در محلول استخراج شده به روش DNS مورد سنجش قرار گرفت. در این روش1mLاز محلول حاوی آنزیم را با محلول 1 mLمحلول%0/9 پکتین و1 mL بافر استات 0/1 مولار به مخلوط کرده و برای30 دقیقه در دمای 45 0C نگه داشته، سپس یک میلی لیتر از نمونه مذکور را با یک میلی لیتر از محلول بافر سیترات با غلظت0/1 مولار به خوبی هم زده و سپس 3 mLمعرف DNS اضافه کرده و به مدت10 دقیقه در دمای90 0C قرار داده و سپس محلول حاصل سانتریفوژ شده تا مواد نامحلول جدا گردد و میزان جذب محلول شفاف حاصل در طول موج 600 nm خوانده شد.[1]
4-2 طراحی آزمایش و تجزیه و تحلیل آماری:
برای بهینه سازی میزان تولید آنزیم به روش سطح پاسخ و تاگوچی، چهار فاکتور دما، رطوبت،pH و زمان تخمیربر میزان تولید پکتیناز مورد تحقیق قرار گرفت. دو سطح از هر فاکتور بر طبق جدول (1)انتخاب و با استفاده از نرم افزار Minitab آزمایش های لازم طراحی شد.
در روش سطح پاسخ 28 محیط مختلف بدست آمد که تمام ترکیب های ممکن فاکتورها و سطوح مربوطه را شامل می شود. جدول (2) تیمارهای یادشده را به همراه میزان تولید آنزیم پکتیناز در هر تیمار نشان می دهد. بعد از انجام آزمایش و سنجش سطوح فعالیت از یک مدل درجه دوم معادله 1 برای ارتباط بین فاکتورهای تخمیر و میزان پکتیناز تولید شده استفاده گردید:
سپس تحلیل سطح پاسخ با استفاده از سطح برازش شده انجام می گیرد.
هنگام استفاده از روش تاگوچی جهت طراحی ،آزمایشهای فوق 32 تیمار در قالب آرایه متعامدL-42 صورت پذیرفت. جدول طراحی آزمایشها با این روش در بخش نتایج ذکرشده است (جدول.(4
-3 نتایج و بحث:
1-3 بررسی نتایج بهینه سازی به روش سطح پاسخ:
تجزیه واریانس نشان می دهد که سه فاکتور رطوبت، دما و زمان هم به صورت خطی و هم بصورت درجه دوم تغییر معنی داری بر تولید پکتیناز دارد در صورتی که pH فقط در شکل خطی اثر معنی دار بر تولید داشته و همچنین فاکتورهای دما و زمان تخمیر و فاکتورهای رطوبت و زمان تخمیر نیز بر یکدیگر برهمکنش نشان می دهند.
معادله 2 رابطه بین پکتیناز تولیدی و چهار فاکتور مورد بررسی را نشان می دهد.
نتایج مربوط به فاکتورهای دارای برهم کنش دربهینه سازی در این طراحی در نمودارهای 1و2 آورده شده است.
همانطور که شکل 1 بیان می کند در سطح0/5> Temperature<1 یعنی هنگامی که که دما بین دمای 37 تا 40 درجه سانتیگراد و Time در سطح -1 یعنی مدت زمان تخمیر 3 روز باشد ما حداکثر تولید و در دماهای کمتر از 30 0Cحداکثر تخمیر ما در مدت زمان بیشتری صورت می گیرد.
